蛋白质两性解离实验步骤

如题所述

  实验:蛋白质两性性质及等电点的测定

  目的要求

  (1)了解蛋白质的两性性质。

  (2)掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。

  实验原理

  蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的基团除N端α―氨基与C端α―羧基外,还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团,如酚基、巯基、胍基、咪唑基等基团,它们都能解离为带电基团。因此,在蛋白质溶液中存在着下列平衡:

  阳离子两性离子阴离子

  pH < pIpH = pIpH > pI

  电场中:移向阴极不移动移向阳极调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等,即所带正负电荷相等,净电荷为零,此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。在等电点时,蛋白质溶解度最小,溶液的混浊度最大,配制不同pH的缓冲液,观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可确定蛋白质的等电点。

  试剂和器材

  一、试剂

  1mol/L乙酸:吸取99.5%乙酸(比重1.05)2.875mL,加水至50mL。

  0.1mol/L乙酸:吸取1mol/L乙酸5mL,加水至50mL。

  0.01mol/L乙酸:吸取0.1mol/L乙酸5mL,加水至50mL。

  0.2mol/L NaOH:称取NaOH2.000g,加水至50mL,配成1mol/L NaOH。然后量取1mol/L NaOH 10mL,加水至50mL, 配成0.2mol/L NaOH。

  0.2mol/L HCl:吸取37.2%(比重1.19)HCl 4.17mL,加水至50mL,配成1mol/L HCl。然后吸取1mol/L HCl 10mL,加水至50mL,配成0.2mol/L HCl。

  0.01%溴甲酚绿指示剂:称取溴甲酚绿0.005g,加0.29mL 1mol/L NaOH,然后加水至50mL。

  二、测试样品

  0.5%酪蛋白溶液:称取酪蛋白(干酪素)0.25g放入50mL容量瓶中,加入约20mL水,再准确加入1mol/L NaOH 5mL,当酪蛋白溶解后,准确加入1mol/L乙酸5mL,最后加水稀释定容至50mL,充分摇匀。

  三、器材

  试管1.5×15cm(×8);移液管1mL(×4),2mL(×4),10mL(×2);胶头滴管(×2)。

  操作方法

  一、蛋白质的两性反应

  (1)取一支试管,加0.5%酪蛋白1mL,再加溴甲酚绿指示剂4滴,摇匀。此时溶液呈蓝色,无沉淀生成。

  (2)用胶头滴管慢慢加入0.2mol/L HCl,边加边摇知道有大量的沉淀生成。此时溶液的pH值接近酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化。

  (3)继续滴加0.2mol/L HCl,沉淀会逐渐减少以至消失。观察此时溶液颜色的变化。

  (4)滴加0.2mol/L NaOH 进行中和,沉淀又出现。继续滴加0.2mol/L NaOH,沉淀又逐渐消失。观察溶液颜色的变化。

  二、酪蛋白等电点的测定

  (1)取同样规格的试管7支,按下表精确地加入下列试剂:

  试剂(mL)
  管号

  1
  2
  3
  4
  5
  6
  7

  1.0mol/L 乙酸
  1.6
  0.8
  0
  0
  0
  0
  0

  0.1mol/L 乙酸
  0
  0
  4
  1
  0
  0
  0

  0.01mol/L 乙酸
  0
  0
  0
  0
  2.5
  1.25
  0.62

  H2O
  2.4
  3.2
  0
  3
  1.5
  2.75
  3.38

  溶液的pH
  3.5
  3.8
  4.1
  4.7
  5.3
  5.6
  5.9

  混浊度

  (2)充分摇匀,然后向以上各试管依次加入0.5%酪蛋白1mL,边加边摇,摇匀后静置5min,观察各管的混浊度。

  (3)用-、+、++、+++等符号表示各管的混浊度。根据混浊度判断酪蛋白的等电点。最混浊的一管的pH值即为酪蛋白的等电点。

  注意事项

  在测定等电点的实验中,要求各种试剂的浓度和加入量相当准确。

参考资料:http://biochem.sjtu.edu.cn/experiment9.htm

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