实验原理
蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的基团除N―端α―氨基与C―端α―羧基外,还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团,如酚基、巯基、胍基、咪唑基等集团,他们都能解离为带电基团。因此,在蛋白质溶液中存在着下列平衡:
阳离子 两性离子 阴离子
pH < pI pH = pI pH > pI
电场中: 移向阴极 不移动 移向阳极
调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等,即所带正负电荷相等,净电荷为零,此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。在等电点时,蛋白质溶解度最小,溶液的混浊度最大,配制不同pH的缓冲液,观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可确定蛋白质的等电点
试剂和器材
一、试剂
1mol/L乙酸:吸取99.5%乙酸(比重1.05)2.875ml,加水至50ml。
0.1mol/L乙酸:吸取1mol/L乙酸5ml,加水至50ml。
0.01mol/L乙酸:吸取0.1mol/L乙酸5ml,加水至50ml。
0.2mol/LNaOH:称取NaOH2.000g,加水至50ml,配成1mol/LNaOH。然后量取1mol/L NaOH 10ml,加水至50ml,配成0.2mol/L NaOH。
0.2mol/L盐酸:吸取37.2%(比重1.19)盐酸4.17ml,加水至50ml,配成1mol/L盐酸。然后吸取1mol/L盐酸10ml,加水至50ml,配成0.2mol/L盐酸。
0.01%溴甲酚绿指示剂:称取溴甲酚绿0.005g,加0.29ml 1mol/L NaOH,然后加水至50ml。
0.5%酪蛋白溶液:称取酪蛋白(干酪素)0.25g放入50ml容量瓶中,加入约20ml水,再准确加入1mol/L NaOH 5ml,当酪蛋白溶解后,准确加入1mol/L乙酸5ml,最后加水稀释定容至50ml,充分摇匀。
二、器材
试管架,试管:15ml×6,刻度吸管:1ml×4,2ml×4,10ml×2,胶头吸管×2。
操作方法
一、蛋白质的两性反应
(1)取一支试管,加0.5%酪蛋白1ml,再加溴甲酚绿指示剂4滴,摇匀。此时溶液呈蓝色,无沉淀生成。
(2)用胶头滴管慢慢加入0.2mol/L盐酸,边加边摇知道有大量的沉淀生成。此时溶液的pH值接近酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化。
(3)继续滴加0.2mol/L盐酸,沉淀会逐渐减少以至消失。观察此时溶液颜色的变化。
(4)滴加0.2mol/L NaOH 进行中和,沉淀又出现。继续滴加0.2mol/L NaOH,沉淀又逐渐消失。观察溶液颜色的变化。
二、酪蛋白等电点的测定
(1)取同样规格的试管7支,按下表精确地加入下列试剂:
试剂(ml)
管号
1
2
3
4
5
6
7
1.0mol/L 乙酸
1.6
0.8
0
0
0
0
0
0.1mol/L 乙酸
0
0
4
1
0
0
0
0.01mol/L 乙酸
0
0
0
0
2.5
1.25
0.62
H2O
2.4
3.2
0
3
1.5
2.75
3.38
溶液的pH
3.5
3.8
4.1
4.7
5.3
5.6
5.9
(2)充分摇匀,然后向以上各试管依次加入0.5%酪蛋白1ml,边加边摇,摇匀后静置5min,观察各管的混浊度。
(3)用-、+、++、+++等符号表示各管的混浊度。根据混浊度判断酪蛋白的等电点。最混浊的一管的pH值即为酪蛋白的等电点。
注意事项:
缓冲液的pH值必须准确。
希望能满意
参考资料:书