一论述题:如何克隆一个功能性基因,如何在原核系统中高效表达?小女不太了解分子方面的,又急用,望哪位大侠帮忙解答一下这道论述题,不要只有三言两语高度概括的那种。。。不胜感激!!!
额,太多了,你能帮我总结一下吗?这只是一道论述题
追答简述如下:
1、如何克隆:
原核生物不能直接识别和正确表达真核细胞的基因。要使真核基因在原核细胞中正确表达,需要进行一定的修饰:
(1)对控制相关的功能性蛋白的mRNA上的 与核糖体结合位点的碱基序列进行修饰,使之能与原核系统的核糖体正确结合;
(2)修饰后的mRNA进行反转录,获取不含内含子的cDNA片段。
获取目的基因(cDNA)模板后,可以通过PCR技术进行扩增。
2、如何高效表达外源基因
需要考虑以下原则:
1、优化表达载体的设计。在构建表达载体时对决定转录起始的启动子和决定 mRNA 翻译的SD序列进行优化,提高外源基因的表达效率。
2、提高稀有密码子 tRNA 的表达作用。在 mRNA的翻译过程中,往往会由于外源基因中含有过多的稀有密码子而使细胞内稀有密码子的 tRNA供不应求,最终使翻译过程终止或发生移码突变。此时可通过点突变等方法将外源基因中的稀有密码子转换为在受体细胞中高频出现的同义密码子。
3、提高外源基因 mRNA 的稳定性,减少核酸外切酶可能对外源基因 mRNA的降解。
4、提高外源基因表达产物的稳定性。大肠杆菌中含有多种蛋白水解酶,在外源基因表达产物的诱导下,蛋白水解酶的活性可能会增加。因此,须采用多种措施提高外源蛋白在大肠杆菌细胞内的稳定性(如将外源基因的表达产物转运到细胞周质或培养基中等)。
5、优化发酵过程,使外源基因在特异的时空进行高效表达,提高表达产物的产率。在保持单个细胞基因表达水平不变的前提下,提高菌体密度可望提高外源蛋白质合成的总量。
这题目考查的就是基因工程的步骤,详细叙述下基因工程的步骤即可。
提取目的基因:主要有两条途径:如果目的基因序列已知,则用限制性内切酶从供体细胞的DNA中直接分离基因;如果序列未知,则人工合成基因。直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”,用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段,将这些片段分别载入运载体,然后通过运载体分别转入不同的受体细胞,让供体细胞提供的DNA(即外源DNA)的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制(在遗传学中叫做扩增),从中找出含有目的基因的细胞,再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来;人工合成基因的方法主要有两条:一条途径是以目的基因转录成的信使RNA为模版,反转录成互补的单链DNA,然后在酶的作用下合成双链DNA,从而获得所需要的基因。另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列,推测出相应的信使RNA序列,然后按照碱基互补配对的原则,推测出它的基因的核苷酸序列,再通过化学方法,以单链核苷酸为原料合成目的基因。
目的基因与运载体结合:这是基因工程的核心,三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。如果以质粒作为运载体,首先要用一定的限制酶切割质粒,使质粒出现一个缺口,露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因,使其产生相同的黏性末端。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处,首先碱基互补配对结合,两个黏性末端吻合在一起,碱基之间形成氢键,再加入适量DNA连接酶,催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键,从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来,形成一个重组DNA分子。
将目的基因导入受体细胞:基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌,枯草杆菌,土壤农杆菌,酵母菌和动植物细胞等。题目为原核系统,如受体细胞是细菌,一般是将细菌用氯化钙处理,以增大细菌细胞壁的通透性,使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的基因导入受体细胞后,就可以随着受体细胞的繁殖而复制,由于细菌的繁殖速度非常快,在很短的时间内就能够获得大量的目的基因。
目的基因的检测和表达:目的基因导入受体细胞后,是否可以稳定维持和表达其遗传特性,只有通过检测与鉴定才能知道。检测的方法有很多种,例如,大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因,当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒,并被转入受体细胞后,就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后,受体细胞必须表现出特定的性状,才能说明目的基因完成了表达过程。
以某种细菌标准株NDA为模板,根据已知的基因序列,运用软件自行设计合成该基因的引物进行扩增。这是不是你所说的 “如果目的基因序列已知,则用限制性内切酶从供体细胞的DNA中直接分离基因”?
追答这个是已知序列,但它是通过合成基因,接下来需要用限制性内切酶剪切,是的。