在测序前如何进行pcr产物的酶切纯化，注意我想知道的是用于测序的pcr产物酶切纯化，不是用于克隆的酶切。

Question

如题所述

Answer 1

这种方法有比较大的局限性，要求pcr产物条带要单一，如果有杂带的话测序结果肯定就是一堆的套峰了。
这种方法是采用虾碱酶（SAP，Shrimp Alkaline Phosphatase）和外切酶I的混合溶液，来消化pcr扩增体系中多余的dNTPs和引物，以便后面的测序。一般使用的终浓度为1ul混合溶液中，含有虾碱酶0.6单位，外切酶I1.2个单位，这个比例也可以自己通过试验来调整。
一般是1ulpcr产物加2ul溶液。37度孵育15分钟，即可除去多余的引物以及dNTPs，然后80度，15分钟就可以使虾碱酶失活。
这个方法的优点是简单、快速、省钱、不损失样品，缺点是对样品要求高，如果一次纯化测序结果不好还要重来，费时费力。所以现在测序公司一般都是使用胶回收试剂盒来纯化，这样虽然工作量比较大，费钱，但基本可以保证一次成功，总体看来还是省时省力的。

Answer 2

你说的两者并没有本质区别。可以有几种方法来纯化：

最简单的：酶切完成后，做一个有双排孔的胶（也有卖的）。把要分离的混合物加在上一排，然后跑电泳，随时观察，等要纯化的那个条带抛入下一排的孔时，切断电源，直接吸出来就可以了。可以用来直接测序。

或者使用PCR 纯化试剂盒，一般都可以清除切下来的小片段核酸。要注意的是最后一步洗脱液内不要有EDTA （比如TE缓冲液），有可能干扰测序的酶活性。追问

就是用SAP纯化酶法纯化单一条带的pcr产物，不需要割胶纯化，具体步骤如何进行

追答

最简单就是用试剂盒，原理就是亲和柱，再洗脱。

Answer 3

楼上t说的是一t方6面。 PCR产物测序也x是可以5的，可以8送粗样，也o就是不n纯化8的，也h可以2送纯化6好的。但很多公1司测的不d是很好，所以7一l般建议转到克隆载体中3保存了t送菌液或质粒测序。 PCR产物纯化4是去除多余的dNTP和引7物二e聚体。用纯化4好的片6段连接转化1可以3降低背景，提高转化3效率。通常转化0后我们用几r种方0法来确认6转化7子n，抽质粒酶切3是比6较可靠的。选择酶切5大k小w与z预计4一d致的克隆去测序。lさiㄅh┳拧┑otpy筏ks┞ㄟh┳拧┑追问

就是用SAP纯化酶法纯化单一条带的pcr产物，不需要割胶纯化，具体步骤如何进行