1 细菌污染简介
1.1 污染的原因
在培养过程中污染是经常发生的，它会导致培养基和培养材料上滋生杂菌，最终导致组培失败。在科研和商品化生产种苗中，污染率是与经济效益紧密相关的一个重要指标，控制污染率无疑是一项提高经济效益、节约材料的有效途径之一。因此，探讨和重视污染在科研和生产中显得十分重要。
1.2 操作污染和环境污染
操作污染和环境污染指真菌污染和细菌污染。真菌污染主要来源于环境，细菌污染主要来源于接种材料及工具。此类污染可通过如下措施加以克服：
1.2.1 改善环境条件
每次接种前应对接种室的地面进行清洁卫生工作，并用75%的酒精喷雾使空气中的灰尘沉降，并用紫外线灯在黑暗中照射20~30分钟。接种前工作台面要用新洁尔灭或75%酒精擦洗，使用超净工作台对接种环境污染的控制更有成效。但超净工作台应置放在洁净的房间，窗户密封，并定期清洗过滤膜，以延长使用寿命。培养室的相对湿度应控制在70%左右，相对湿度太高时可以用抽湿机除湿。在接种结束时，应进行地面清洁卫生工作，即先打扫一遍，再用湿布擦过，并定期用甲醛熏蒸接种室。
1.2.2 无菌操作
工作人员使用的工作服、帽子、口罩等，要经常保持干净，并定期进行消毒。在接种前要剪除指甲，并用肥皂或洗衣粉溶液擦洗，最好再在新洁尔灭溶液中浸泡10分钟，后用75%的酒精擦手，并用75%的酒精擦拭母种瓶表面进行消毒，以防把微生物带进超净工作台。同时要求工作人员在接种时，最好不要感冒咳嗽和说话。
1.2.3 严查接种材料
淘汰被细菌污染过的接种材料。
1.2.4 经常检查消毒锅的灭菌质量
消毒锅的压力表降到零后不能马上出锅。因冷热空气作用的负压效应，使外界环境的冷空气倒吸入已灭菌好的培养瓶内引起真菌污染，为避免该现象的发生，消毒后培养瓶应留在锅里，等冷却后才出锅。如果出现培养基造成的污染，就要及时地检查灭菌锅的性能或其他的问题。
1.2.5 检查培养容器是否存在问题
培养容器封口多用塑料盖、胶塞、棉塞、薄膜等，塑料盖用久了易老化，密封性差，也会造成污染。同时，培养瓶在使用之前要洗净（包括瓶内瓶外），灭好菌的培养瓶不要放在空气中太久，一般出锅后1~2天内接完种最好，以减少培养瓶表面的微生物引起的污染。
2 内源性污染的控制在植物组织培养中，由于材料内部的内生菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料进入培养过程，引起的污染称为内生性污染或内源性污染。
2.1 内源性污染的含义
内源性污染是指植物体内存在的微生物，它们在植物生长过程中产生，并随着植物组织的培养而传播。
2.2 内源性污染的种类
从已有报道看，被鉴定的种类主要有：黄单胞菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、土壤杆菌属、棒状杆菌属、欧文氏菌属等。真菌主要有霉菌。目前在各种农作物及果树等蔽档经济作物中发现的内生细菌已超过129种（隶属于54个属）。对于一种植物而言，从中分离到的内生真菌和内生细菌通常为数种至十种，有的还到百种之多，其主要出现在热带植物组织中。
2.3 内源性污染的分布
内源性污染主要发生在那些生长在高温多雨的热带、亚热带和多年生木本植物，尤其是在污染较严重的地区，如工业区，人口众多的城市，公路边等。
2.4 内源性污染的症状和危害性
在初代培养中，表面细菌引起的污染通常在2~3天就能在外植体周围或培养基表面形成明显的如水污状、油污状、气泡或干缩的红、黄、乳白等颜色的菌落。而在外植体培养后3~5天内并未发现细菌污染，以后则不断出现明显的或不明显的细菌菌落，就可能是由内生细菌引起的污染。对于这种情况，我们可以利用背光检查法去观察发现它。内生细菌引起的危害主要包括在早期导致培养失败，增殖效率降低，培养物生长减慢，玻璃化苗增多等。在后期导致试管苗移栽困难或死亡，有时污染也会引起培养物的遗传变异。
3 细菌污染的防止措施
3.1 外植体的消毒
3.1.1 预栽管理
一般来说，温室内盆栽的植株比室外栽培的植株含菌少，为了能更好地降低污染率，我们要把室外栽培变为室内盆栽。要求：盆栽用土应使用不含有机质及经消毒的清洁土壤，尤其是要采集地下材料时，须用经过消毒蛭石等作栽培基质；施用无机肥，并对植物喷洒杀虫剂和杀菌剂。不便移栽的，可套塑料袋，待长出新枝条后，再采样接种。
3.1.2 外植体预处理
3.1.2.1 促发新枝
将田间采集的枝条用水冲洗干净后插入无糖的培养液或自来水中，使其发枝，后以这种新抽的嫩枝作为外植体，可大大减少内源菌的污染。
3.1.2.2 黄化处理
在无菌条件下，对采自田间的枝条进行暗培养，待抽出徒长的黄化枝条时取材，也可减少污染。这方法曾用于成年栗树的枝条和仙客来实生苗，减少了内生细菌的污染。
3.1.2.3 热击处理
如将美丽百合的鳞茎外植体放入试管中进行43摄氏度热击处理，罗伯利槭的休眠芽进行42.5摄氏度或45摄氏度热击处理；草莓茎尖在30摄氏度处理可得到脱毒苗。
3.1.2.4 用抗生素进行处理
庆大霉素和链霉素，属于氨基糖苷类型，它们与细菌中的30S核蛋白体亚单位结合，抑制细菌的酸苷油酯合成，通过阻断其正常代谢途径使微生物致死。如相思树的茎段灭菌时，用皂液刷洗和75%酒精杀菌后，转入不同的抗生素溶液中，在摇床上振荡过夜，再用75%的酒精和0.1%升汞分别杀菌1分钟和15分钟，灭菌效果（如下表）其中以抑制剂ANB1和ANB2的抑制效果较好，未污染的分别为63.3%和76.7%；成活率分别为60.0%和50.0%。
3.1.3 改进灭菌方法
3.1.3.1 真空减压灭菌
利用真空减压抽走植物组织中的空气，使消毒剂容易侵入，从而增强杀菌效果。经对万年青茎段的实验可知道：减压灭菌的效果明显优于常规灭菌（如下表）未污染率从常规的6.7%升到60.0%，成活率从常规的3.3%升到43.3%。
3.1.3.2 磁力搅拌、超声波振动法
为减少在外植体表面形成的气泡，在浸泡时还可采用磁力搅拌和超声波振动的方法。如对月季、苹果的枝条，用0.1%升汞磁力搅拌15~20分钟，再用无菌水磁搅拌清洗，污染率有所下降。
3.1.3.3 灼烧灭菌
利用火烧的方法杀死外植体表面的所有微生物，以不伤害所要使用的组织或细胞为度。如将马蹄莲的根在95%的酒精中浸泡1分钟后，短时间内灼烧2次，比常规消毒的污染率降低60%。这种方法已用在绿色豆果、蒜的小鳞茎和银白杨芽的消毒。
3.1.3.4 酸化培养基
除了欧文氏菌属外，大多数细菌在介质PH小于4.5时不能生长。在紫苑属、鸢尾属、蔷薇属植物组织中，将培养基的PH5.8降到3.9~4.3，可防止大量的细菌污染。
3.1.3.5 其他
多次消毒如先用皂液对番木瓜侧芽浸泡20~30分钟，再用0.1%高锰酸钾溶液处理5分钟，然后进行消毒处理，然后用4%次氯酸钠加0.1%升汞消毒，最后用无菌水洗，污染率降低为50%左右；使用混合消毒液是用几种消毒液(如多菌灵、抗坏血酸、柠檬酸、氯霉素等混合
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