(1)总活力(total activity)的回收率:是表示分离纯化过程中酶的损失情况。
(2)比活力(specific activity)提高的倍数:比活力是指在特定的条件下,1mg酶蛋白所具有的酶活力单位数,其提高的倍数是表示分离纯化方法的有效程度。
酶溶法利用酶反应,分解破坏细胞壁组分的特殊化学键,从而达到破碎细胞目的。
酶溶法可以分为外加酶法和自溶法两种。
化学渗透法
某些化学试剂,如有机溶剂、变型剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等,可以改变细胞壁或膜的通透性,从而使胞内物质有选择的渗透出来,这种处理方法称为化学渗透法。
什么是饱和度?
溶液中饱和硫酸铵的体积与溶液总体积之比.
例如:在60ml的酶液中加入40ml的饱和硫酸铵溶液,则次盐析液中硫酸铵的浓度为:
(40/(60+40))X 100%=40%
等电点法
定义:利用蛋白质在等电点时浓度最低以及 不同的蛋白质具有不同的等电点的特性,对蛋白质进行分离纯化的方法。
酶的纯化方法从原理上看可分为几种类型:1,利用一种酶相对于其他酶溶解度不同的沉淀法;2,依据酶在两相间分配作用不同的相分配法;3,利用酶对固体载体的吸附性质不同,通过拄层析方式将它们分别洗脱下来的拄层析法;4,依据酶在电场或离心场中运动速度不同的电泳法或离心法。上述提纯方法的适当结合,在多数情况下,足以获得纯化的酶。
膜分离是利用一种特殊的具有选择透过功能的薄层物质(称为分离膜),使流体内的一种或几种物质通过,而其他物质不能通过,从而起到浓缩和分离纯化作用的技术。
膜分离技术一般分为反渗透、超滤、纳滤、微滤,它们主要区别在于膜孔径的大小。在酶的纯化中常用的是超滤和微滤。
试验液中的大分子不能穿过半透膜而被截留与膜内,可透析的小分子经扩散作用不断透过半透膜而相互渗透,这种现象称为透析。
透析袋孔径大小可经机械作用或理化处理而改变。
线形膨胀可使孔径减小至50%,而放射形膨胀作用由于管内液体静压力加大,可使管膜孔径增加1~2倍以上。
某些小分子溶质的渗透性也因溶液中存在微量表面活性剂而增加,可能是由于它们吸附在膜的”活性位置”上,改变了膜的理化特性。
已成商品干燥的透析袋在制备时曾用10%的甘油处理过,以防干燥脆裂,并含有极其微量硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质。50%乙醇处理对除去具有紫外吸收杂质特别有效。
超滤膜的性能指标:渗透通量和截流量
额定截留水平表示每中超滤膜所规定截留溶质分子质量的范围。在这个范围内,绝大多数溶质分被膜截留。截留分子质量愈大,膜的表关孔径愈大,反之膜的表关孔径愈小。一般选用额定截留水平稍低于所分离、浓缩的溶质分子质量。
流率可用在一定压力下每分钟通过单位面积膜的液体量来表示(一般用无离子水进行测定)。实验中常用ml/cm2/min表示流率单位。流率大小不仅和膜的表现空径大小有关,而且和膜的结构有关。
影响流速的几个因素
1)溶质的分子性质
2)溶质浓度
3)压力
4)搅拌
5)温度
6)其他
干凝胶的用量(g)= ∏r*r*h/膨胀度(床体积/g)
可采用细长的层析柱,柱长:柱内径=50:1或100:1
装柱的方法分为干装法和湿装法两种
上样量与测定方法和层析柱大小有关。如测定样品含量的方法灵敏或床体积小时,加样量可少,否则反之。
加样量掌握得当,可提高分离效果。一般来说,加样量越少,或加样体积越小(样品浓度高时),分辨率越高。但是,当用于样品的制备和脱盐时,加样量应在不影响分辨率的前提下增大。
凝胶过滤的应用
(1)脱盐
(2)用于分离提纯
(3)测定高分子物质的相对分子质量
(4)高分子溶液的浓缩
作为离子交换剂应满足以下条件:
1.有高度的不溶性
2.有疏松多孔的结构或巨大的表面积
3.有较多的交换集团
4.有稳定的物理化学性质
梯度的形成:
1、增加溶液的离子强度用一简单的盐(如NaCl)溶于稀缓冲液中;
2、改变溶液的PH,若使用的是阳离子交换剂,PH应从低到高递增;使用阴离子交换剂,则应从高到低递减。(实际许可的PH范围应由待分离物质的稳定PH范围和离子交换剂限制的PH范围来决定)
离子交换剂再生:使用过的离子交换剂恢复原来的性状。(通过上述的酸碱反复处理即可,但有时也可借助转型处理来完成)
常用吸附介质
一.活性炭
二.硅胶
三.磷酸钙
等电聚焦
等电聚焦是一种高分辨率的蛋白质分离技术。它是利用蛋白质或其他两性电介质物质具有不同的等电点,从而在一个稳定,连续,线形的PH梯度中得到分离。
酶结晶
原理:酶作为一种生物大分子,分子量大,结构复杂,且不稳定和敏感,不易定向聚集。所以结晶条件苛刻,要维持在水合状态,处于或接近生理pH及温度的条件下结晶。此外,确保酶的天然活性是至关重要的。只有当酶溶液处于过饱和状态才有析出晶体的可能。我们一般采用重结晶的方法提高纯度,得到更好的酶结晶。
酶结晶的要求
1.酶的纯度
2.酶的浓度
3.结晶温度
4.溶液的ph
5.离子强度
酶结晶的方法
1.盐析法
2.有机溶剂法
3.等电点法
4.金属离子法
5.温差法
参考资料:查