质粒DNA怎么提取?

Question

如题所述

Answer 1

试述碱裂解法提取质粒的基本原理及关键试剂的作用如下：

将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。

尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。只要用碱处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。

在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用K+取代Na+时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。

在SDS存在的条件下，碱水解是一项非常灵活的技术，它对E.coli的所有菌株都适用，并且其细菌培养物的体积可以从1-500mL以上。

更多内容如下：

在pH12.0~12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽变性但仍处于拓扑缠绕状态。

将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。

通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中,然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

抽提质粒DNA常用碱裂解法，它是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：在碱性条件（pH12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。