单细胞核转录组测序（Single Nuclei RNA Sequencing，snRNA-seq）：通过提取样本单细胞核，然后分离、标记细胞核，在单细胞水平研究核基因表达检测的技术。为脑组织、心脏、肾脏等复杂组织或一些珍稀 冻存样品 提供了单细胞水平研究应用平台，可挖掘更多潜在的致病细胞类型，更易于探讨肿瘤细胞异质性和致病机理。
单细胞悬液制备过程往往是造成实验可变性的主要因素。如何获得足质足量的单细胞悬液？这是实验面临的第一个难题，特别是那些稀有细胞或难以解离的细胞；细胞核膜相比细胞膜更为坚固，因此，冻存组织细胞膜破裂后细胞核则能够保持完整，由于仅涉及机械破碎和简单的纯化，snRNA-seq操作步骤相对简化，便于开展实验，其稳定性相比scRNA-seq大大提高。
单细胞核测序snRNA-seq由于是抽提细胞核进行测序，所以可以应用于冻存的样本，极大的利用了那些生理病理数据清晰的冻存样本；对于那些新鲜样本解离成功率低的样本；或者是样本的收集难度大，收集周期长，比如一个样本不同阶段的评估，或者根据治疗结果决定前端样本是否入组等情况；亦或是细胞体积大，形状不规则的样本都可以用snRNA-seq来解决。
因为组织可以直接从冻存状态开始抽核，此状态下细胞转录活动已经被抑制并固定，因此不会再发生转录状态改变，结果真实性提高。
直接对细胞进行机械法或者化学法破碎，不会引入解离偏好性，理论上来讲所有细胞类型都能得到回收，能够获得更加完整和全面的细胞图谱。
虽然有一些比较单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞核（snRNA-seq）测序的研究表明，转录本在整个细胞和细胞核中的表达程度相当；理论上来讲，缺失了细胞质中的RNA分子，snRNA-seq在鉴定细胞转录状态中可能不如scRNA-seq，同时由于细胞核中带有polyA尾的成熟mRNA比例更低，因此对于某些样本而言，采用snRNA-seq每个细胞核中检测到的基因可能会有偏少的风险，不利于细胞亚型的鉴定。
虽然snRNA-seq能够获得更加全面完整的细胞类型，但是对于某些细胞类型的获得比例不如scRNA-seq，主要表现为免疫细胞。
Slyper, M., Porter, C.B.M., Ashenberg, O. et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med 26, 792–802 (2020). https://doi.org/10.1038/s41591-020-0844-1
以上这篇文章对8个肿瘤类型，同时进行scRNA-seq和snRNA-seq，结果发现：scRNA-seq数据中神经嵴、神经内分泌细胞大幅度减少、实质细胞大幅度减少；snRNA-seq数据中T细胞大幅度减少、B细胞和NK细胞消失、内皮细胞、上皮细胞增加。
https://zhuanlan.zhihu.com/p/394585391
这里主要讲一下核mRNA和细胞mRNA的区别：在细胞和里面主要有大量的pre-mRNA，这部分有内含子信息。一般的数据经验是PBMC内含子比对上的约为20%，核转录组45%。
https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360000087552-Why-do-I-have-a-high-percentage-of-reads-mapping-to-intronic-regions-
要理解这个过程，需要了解意向mRNA的形成和核运输的基本机制。同时要知道被我们捕获的PolyA是什么时候加到3‘端的。这里推荐阅读《基因X》。
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然后我们看看文章里面是如何做的：
https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360004350911-How-can-the-percentage-of-reads-aligned-to-Exonic-Regions-be-greater-than-those-aligned-to-the-Transcriptome-
考虑到核mRNA的差异，在下游分析的时候还是有一些需要注意的地方的。
Habib, N., Avraham-Davidi, I., Basu, A. et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nat Methods 14, 955–958 (2017). https://doi.org/10.1038/nmeth.4407
虽然单细胞核的平均表达谱与单个细胞的平均表达谱高度相关(Pearson r=0.87)，但在细胞核(如lncRNAs Malat1和Meg3)或细胞(线粒体基因Mt-nd1、Mt-nd2、Mt-nd4、Mt-nd4)中表达显著较高的基因(如lncRNAs Malat1和Meg3)或细胞(线粒体基因Mt-nd1、Mt-nd2、Mt-nd4、Mt-cytb)与已知的核与非核的明显富集相一致。
http://wordpress.uchospitals.edu/basu-lab/droncseq/#:~:text=DroNc-Seq%3A%20Deciphering%20cell%20types%20in%20human%20archived%20brain,and%20to%20certain%20tissues%20such%20as%20adult%20brain .
单细胞核测序能不能测到 线粒体基因？ 让我们看一个实例：
Al-Dalahmah, O., Sosunov, A.A., Shaik, A. et al. Single-nucleus RNA-seq identifies Huntington disease astrocyte states. acta neuropathol commun 8, 19 (2020). https://doi.org/10.1186/s40478-020-0880-6
Nuclei with percent exonic reads from all reads in the range of 25–75% were included. Nuclei with percent mitochondrial reads aligning to mitochondria genes of more than 14% were excluded. Genes were filtered by keeping features with > 10 counts per row in at least in 31 cells.
https://github.com/jgamache014/snRNA-seq-workflow