第1个回答 2019-04-10
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快速微量提取法
A.取1.5ml
菌体
培养物
于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min,
丢去上清夜，收集菌体。
B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。
C.然后加入200ul5mol/L的
氯化钠溶液
，混匀后于13000rpm离心15min。
D.取
上清液
，用
苯酚
抽提2次，氯仿抽提1次。
E.加两倍
体积
无水乙醇
，1/10体积醋酸钾(3M
,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE
溶液
中，置4oC保存备用。
2
蛋白酶/SDS法制备
先用10ml含适当
抗生素
的GBM过夜培养Delftia
sp.，第二天4000rpm离心10min收集菌体，用Washing
TE（50mmol/LTris-HCl
pH8.0,10mmol/LEDTA
pH8.0）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml
1×
TE缓冲液
中，先后加入0.5ml
5mg/L的蛋白酶、0.5ml
10%
SDS，轻轻混匀后50℃放置3h~5h，接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自动移液器
吸管
头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。
3
1)
细菌培养：细菌接种于5ml
液体培养基
中，37℃摇床（300rpm）培养过液。
2)
细菌收集：取1ml培养物于1.5ml
EP管中，室温8000rpm离心5min，弃
上清
，沉淀重新悬浮于1ml
TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。
3)
菌体裂解：加入6μl
50mg/ml的
溶菌酶
，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS
110μl，20mg/ml的蛋白酶K
3μl，50℃作用3h或37℃过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）
4)
抽提：菌液均分到两个1.5ml
EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）
5)
沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1
2000rpm离心10min。
6)洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。
7)
抽（凉）干后，溶于50μl
ddH2O中，取2-5μl
电泳
。作PCR模板用。