请问：怎样知道某种植物蛋白质的等电点?

Question

请问：怎样知道某种植物蛋白质的等电点？如能从实验中得出，请通俗的加以解释其方法（抱歉因对此项不是特别内行，请谅解，因此名词术语不能用得太专业）

Answer 1

科技名词定义
中文名称：等电点 英文名称：isoelectric point 定义：蛋白质或两性电解质(如氨基酸)所带净电荷为零时溶液的pH，此时蛋白质或两性电解质在电场中的迁移率为零。符号为pI。 所属学科： 生物化学与分子生物学(一级学科) ；氨基酸、多肽与蛋白质(二级学科)

等电点聚焦测蛋白质等电点

一、实验原理

等电点聚集实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方

法。在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性电解载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的PH梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的PH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为零的区带，这时的PH则是这种蛋白质的PI。IEF技术的关键是得到一定范围的稳定的PH梯度。也即找到合适的两性载体。

二．实验试剂

1．丙烯酰胺单体储液

丙烯酰胺[Aa]30%[W/V]，甲叉双丙烯酰胺[Bis]0.8%[W/V]

2．核黄素 0.025%[W/V]

3．Ampholien PH3.5-9 凝胶工作液 Aa：Bis 1ml

甘油 0.25ml

Ampholine PH 3.5-9 0.4ml

双蒸水 3.25ml

摇匀，用水泵抽气10分钟，加入0.025%核黄素0.15ml，摇匀后用滴管灌入玻管中。

4．25%[W/V]蔗糖水溶液，用于配制蛋白样品

5．10%蔗糖水溶液，用来铺于样品层上部。

6．电极液： 上槽 0.02M H3PO4 1000ml

下槽 0.01M NaOH 600ml

7．染色液： 0.01%考马斯亮蓝R-250

5%三氯乙酸

5%磺基水杨酸

三．实验仪器与器具

玻璃管4×120mm 4支

封口膜

试管架

细长滴管

注射器及长针头

玻片、刀片

10ml玻璃瓶

微量可调移液器

圆盘电泳槽及电泳仪

四．操作步骤

1．圆柱体凝胶制备，用封口膜将玻管（4×120mm）的一端封口，将玻管套上橡皮塞，加入凝胶混合液至10cm处，轻轻铺上一层双蒸水，置于日光灯下待其聚合。

2．聚焦电泳

（1）将电泳下槽注入0.01M NaOH、将套有橡胶塞的玻璃管插入电泳槽（注意塞紧所有的孔，以防电极液下露）。将上槽连同电泳管置于下槽上，此时凝胶下端与电极液接触，注意排除凝胶下表面的气泡。

（2）加样100μl蛋白含量2-5μg。

（3）在样品上轻轻一层10%的蔗糖，直至顶端，作为隔离层。

（4）上槽注入0.02M H3PO4，注意不要搅混样品层和隔离层。

（5）接上电源，正极接酸，负极接碱。恒定在120V，通电16-18小时至电流降至0为止。

3．蛋白质染色及等电点测定：

（1）取胶 将凝胶后的含样品的凝胶借助长注射器针头注水取出。

（2）蛋白样品的染色由于两性载体Ampholine可与多种蛋白染色剂结合，并形成不溶性复合物，因此一般需要染色前除去Ampholine。本实验直接将凝胶置于三氯乙酸中浸泡，立刻可见蛋白带。

（3）PH梯度测定 取液，分别加入于10只小玻璃瓶中，将欲测的PH梯度的胶条置于玻璃片上，用刀片切成长的小段，按顺序放入有编号的小玻璃瓶中，盖好橡皮塞，将凝胶段在室温下浸泡过夜，次日用PH计测每支小瓶中浸泡液PH值。将得到的PH值对凝胶长度作图，得标准曲线。

（4）样品的PH值测定。测定出染色蛋白带的位置，在PH梯度曲线上求出相对应PH值既是此样品的PI。

五．实验结果

测定十个小管中胶条的PH分别为7.14、7.86、7.50、6.96、6.38、5.74、5.10、4.49、4.13。以胶条距碱端的距离为横坐标，PH值为纵坐标作图：

经过测量，待测蛋白距碱端为7.3cm，浸泡后胶的总长度为10.5cm，等比例换算得距离应为6.95，带入公式得待测蛋白的PI值为：4.64 查表得知与牛血清白蛋白的等电点接近。

六、讨论

1、载体两性电解质含量2％~3%比较适合，能形成好的梯度。

2、制胶用丙稀酰胺最好是重结晶的。过硫酸铵要新配的。所有的水都要用重蒸水。

3、样品必须无盐，否则电泳时样品条带可能走歪，拖尾或者根本不成条带。加样的量要适当，避免过多电泳后条带不清晰。

4、由于碱性漂移作用，胶条碱端最初1cm的pH值过低，故作图时舍去。

（5）本实验结果中同时加入待测和以前提取两种蛋白（未发现条带,可能样品含盐量过大），待测蛋白在三氯乙酸中固定后即可看到明显的白色条带，故未用染色液染色即可测量迁移距离。

Answer 2

凝胶电聚焦测定蛋白质等电点的操作方法

凝胶电聚焦按形状分为垂直柱状和垂直板状两种，他们的操作基本上分别与普通垂直柱状和板状的凝胶电泳相似。下面以垂直柱状电聚焦测定蛋白质等电点操作为例，进行简要叙述。
加样品
一般加样品量约为25／A1，比较稀的蛋白质样品液可直接加在聚丙烯酰胺凝胶溶液中，也可把样品溶解在10mol／L尿素中(使用变性凝胶系统时)，加在凝胶柱顶部，而后在样品液上覆盖一层1％两性电解质载体，以防酸性或碱性电极溶液破坏蛋白质。
聚焦
聚焦时所用的电极液要根据两性电解质载体的pH值范围而定。随后接通电源，使电压恒定在200V／6cm胶柱。聚焦6～8h，即直接电流恒定在约lmA／管时停止聚焦。
固定与染色
用一般方法从电聚焦完成的玻管中取出胶柱，按下列方法进行固定和染色。
1．氨基黑染色法 将胶柱浸入10％三氯乙酸中，每隔2h换1次，共换约10次(若用旋转法连续不断更新此液固定时间可缩短)。随后把胶柱转移到含0．5％氨基黑的14％乙酸溶液染色，用5％乙酸溶液脱色，此法优点是灵敏度高，缺点是耗时长。
2．考马斯亮蓝染色法 将胶柱浸在12．5％三氯乙酸溶液(4℃)中连续转动，除去胶中的两性电解质后，浸入预热至65℃0．1％考马斯亮蓝固定染色液[考马斯亮蓝R2s。1g，溶于1L三氯乙酸混和液(三氯乙酸150g，磺基水杨酸45g，甲醇375ml，加蒸馏水930m1)]中30min左右，而后用酸性乙醇溶液(乙醇：蒸馏水：冰乙酸＝25；25：8)脱色。此法既快又灵敏。
样品pH值的测定
聚焦完毕，胶柱两端和玻管外壁用蒸馏水洗涤3次，以免沾有电极液而影响真实pH值。随后从玻管中取出胶柱，-70℃冰冻lh，用切片机切成lmm厚的薄片。把两个或两个以上凝胶柱相同位置的薄片，按次序分别浸入0．5mlKCl 0．0／mol／L溶液中，摇动几分钟，依次用微量电极测定其相应pH值。此外，也可将洗涤过的胶柱用刀片按0．5cm长度分段切下，按次序分别浸入4ml 0．1mol／LKCl溶液中，在4℃环境下过夜。移至室温平衡后，测出各段的pH值，以各段胶所在位置，即距离为横坐标，以相对应浸泡液pH值为纵坐标作图，便可绘出胶柱上的pH梯度曲线。
蛋白质的洗脱
用适当方法把凝胶柱切成薄片，然后把各薄片分别放在含有一定量12．5％三氯乙酸溶液的5ml玻璃匀浆管中匀浆，离心后，凝胶块分别用50X乙醇、无水乙醇和乙醚洗涤，用0．1mol／L甲酸溶液抽提3次，收集甲酸溶液冻干，再溶解即可测定其蛋白质含量。
等电点的测定
20世纪80年代初建立的固相pH值梯度电聚焦法(1PGIEF)是一种分辨率很高的pI测定方法。其固相pH梯度凝胶是由一系列弱碱性和弱酸性的丙烯酰胺衍生物与丙烯酰胺和双丙烯酰胺在催化剂作用下形成的。用此衍生物制备固相pH梯度凝胶的过程是，将所需的该物质分别加入盛聚丙烯酰胺的混合瓶和储存瓶中，经适当调节就能形成固相pH梯度凝胶。而它的pH梯度范围则是由酸性和碱性丙烯酰胺衍生物的比例和pK值等因素决定的。
根据胶柱上的染色位置(经校正后)，或洗脱液含有蛋白质的凝胶位置，与pH值的曲线图相对比，即可测出蛋白质的等电点。
另外，用标准蛋白质的等电点(纵坐标)对其在电聚焦中移动的距离(横坐标)作图，即可得到标准的等电点曲线图。当测定未知样品的等电点时，只要在同样的电聚焦条件下求出其移动的距离，就可以从等电点曲线中查出相应的等电点。
这种方法测定等电点的不足之处是，有些蛋白质能与两性电解质载体发生可逆性结合，形成虚假的多重区带，故用它鉴定蛋白质纯度时必须注意。在电聚焦时，改变加样品部位，或改变凝胶中两性电解质的浓度，电泳图谱不会发生改变。另外，电聚焦形成的单一区带再进行电聚焦，其仍然为单一区带时，则表明两性电解质载体和待测样品组分并不互相作用。经过这些检测后，得出的等电点结果是可靠的。

还可以看看这个
tong.dxy.cn/article/9/53/127/8779_1.htm

Answer 3

有预测软件可以预测，实验的话也不能得到非常准确的等电点
你上Expasy，上面有预测工具，输入你的蛋白序列即可