提取总RNA，最少需要多少培养的细胞

Question

如题所述

Answer 1

用Trizol来提取细胞总RNA的话，一个6孔板的细胞足够了。对于贴壁培养的细胞，可将培养基吸出后直接向培养板中加入Trizol来溶解细胞，然后分次移出细胞裂解物进行后续操作即可。值得注意的是，对于所加Trizol的量，是依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定用量的（一般每10cm2加1 ml）。当Trizol量不足时可导致抽提的RNA中污染有DNA。
另外，在Trizol的使用说明中的注意事项提及，如果细胞量太少（100~10000个细胞），可加入800 ul的Trizol，后续裂解、加氯仿按常规操作。在用异丙醇沉淀RNA前加入5-10 ug无RNA酶的糖原作为水相的载体。其会保留在水相，与RNA共沉淀，且不影响后续的逆转录及PCR反应。

Answer 2

1. 加入1ml TRIzol裂解细胞（用手剧烈摇晃），装入1.5ml Eppendorf管中，冰上放置10min。
2. 加入200μl氯仿，震摇15s，冰上放置5min。
3. 13500rpm，4℃离心15min。
4. 收集上清水相一般为500uL，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，冰上放置10min。
5. 13500rpm，4℃离心10min,弃上清。
6. 加入1ml的75%乙醇，上下颠倒混匀后冰上放置5min，12000rpm，4℃离心5min。
7. 弃上清，待残余乙醇挥发殆尽后，沉淀重悬于20μl用DEPC处理水中，存于-70℃。
8. 用分光光度计测OD260/280nm波长的吸光值鉴定RNA浓度，以琼脂糖凝胶电泳证实其完整性。

10-5细胞数，提取的浓度一般检测为500-1000ug/mL