培养细胞如何提取mRNA，如何逆转录？

Question

如题所述

Answer 1

1
细胞总RNA的提取
1）、6孔板细胞（CNE-2）汇合度为90-100%时，取出无菌室，去其上清，用PBS洗两次后，每孔加TRIZOL试剂（Gibco公司）
1
ml，摇匀，无菌罩内消化3-5分钟（观察：液体变粘稠，细胞脱壁）。
2）、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5
ml
EP管中，加新开的氯仿0.2
ml，轻摇15秒。
3）、室温静置2-3分钟后，12000
rpm，15
min，4℃，离心。然后取上清无色水相（约0.6
ml）到
EP管（DEPC处理过），加0.5
ml新开的异丙醇，室温下静置10分钟。
4）、12000
rpm，10分钟，4℃，离心。观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清（小心别丢了沉淀），75%乙醇1.0
ml洗涤（用DEPC水新配制）后，7500
rpm，5
min，4℃离心。
5）、去上清，点离，用小Tip吸干液体。气干沉淀5-10分钟，
DEPC处理水20-30
ul加入，中枪打匀，55-60℃水浴10分钟溶解总RNA，测OD值。
6）、电泳。
2
从总RNA中分离mRNA（Oligotex
mRNA
Mini
Kit,Cat.no.:70022,
QIAGEN）
1）、取上述提取的总RNA若干（少于0.25
mg）到一个新的无RNase
的EP管中，用无RNase的水定容到250
ul。
2）、加入Buffer
OBB
250
ul,
Oligotex
Suspension
15
ul。用Tip打匀或用手弹匀。
3）、70℃水浴，3分钟（裂解RNA的二级结构）。
4）、20-30℃条件下，静置10分钟（让Oligotex与mRNA结合）。
5）、高速离心2分钟，小心吸走上清（该上清要保留），留下约50
ul的上清在原管里。
6）、用Buffer
OW2
400
ul重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀，然后将这些加到套有1.5
ml
EP管的SPIN柱子上，高速离心1分钟。
7）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加Buffer
OW2
400
ul到柱子，高速离心1分钟，丢掉滤过液。
8）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加20-100
ul热的（70℃）Buffer
OEB到柱子上，用Tip来回吸打3-4次，高速离心1分钟。
9）、为保证最大的
mRNA产量，可再次重复第8步。
10）、电泳。
RNA提取的原理就是核酸在异丙醇中的溶解度很低！其他步骤都是防止RNA降解和使RNA从细胞中溶出。
逆转录过程请看参考资料。

Answer 2

楼上说的是错的，逆转录出来的dna是唯一的，不可能有多种可能，因为一种基因的mrna是唯一的！这位同学应该多看看密码子的知识，扯了半天都是与题目无关的。

提取mrna、反转录的操作都是基因工程，但是问题在于：
这句话本身就是错的
！

一言以蔽之，肝脏细胞不表达胰岛素基因！胰岛素基因在肝脏细胞内不转录，没有mrna生成，所以无从提取，也无从反转录！这个实验设计就是失败的。

基因工程首先必须得在合适的标本下进行合适的操作。