双荧光素酶报告基因实验原理？

Question

如题所述

Answer 1

双荧光素酶报告基因实验是常用的生物学实验方法，用于研究基因表达调控和信号转导通路等相关过程。该实验原理基于荧光素酶的荧光反应和其底物荧光素的发光性质。

双荧光素酶报告基因实验

以下是双荧光素酶报告基因实验的基本原理步骤：

1、构建负责表达荧光素酶的载体：在实验中，通常将感兴趣的基因调控区域与荧光素酶基因关联起来，构建成双荧光素酶报告基因的表达载体。这个基因构建过程通常通过分子克隆技术来完成。

2、转染细胞：将上述构建好的表达载体引入目标细胞中。转染方法可以选择适合的化学法、电穿孔法、背景法、病毒载体介导的转染等。

3、荧光素酶检测：将转染后的细胞加入到荧光素酶的底物荧光素溶液中。荧光素酶能够与荧光素底物反应，产生荧光。该荧光信号的强度与荧光素酶的活性成正比。

4、荧光素酶报告基因的内参控制：实验中通常会同时转染一种稳定表达的荧光素酶基因（如Renilla荧光素酶基因），用作内参。这是为了校正在不同样本中可能存在的转染效率等差异。

5、荧光检测仪读数：使用荧光检测仪对加入细胞含有荧光素底物的溶液进行读数。由于两种荧光素酶产生荧光的波长不同，可以使用不同的滤波器进行分别检测。

利用双荧光素酶报告基因实验来研究目标基因的表达水平和调控机制。通过测量荧光素酶和内参荧光素酶的荧光强度，我们可以计算目标基因的相对表达水平，并进一步探索与其相关的信号转导通路或调控因子。

Answer 2

双荧光素酶的实验原理是利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，一般将萤火虫荧光素酶（FLuc）作为报告基因，海肾荧光素酶（RLuc）作为内参基因。构建报告基因质粒，经过细胞转染与裂解，经荧光测定仪检测该报告基因系统中释放的生物荧光，从而反映基因是否存在靶向互作。