阿佛加德罗毕生致力于原子－分子学说的研究。1811年，他发表了题为《原子相对质量的测定方法及原子进入化合物时数目之比的测定》的论文。他以盖·吕萨克气体化合体积比实验为基础，进行了合理的假设和推理，首先引入了“分子”概念，并把它与原子概念相区别，指出原子是参加化学反应的最小粒子，分子是能独立存在的最小粒子。单质的分子是由相同元素的原子组成的，化合物的分子则由不同元素的原子所组成。文中明确指出：“必须承认，气态物质的体积和组成气态物质的简单分子或复合分子的数目之间也存在着非常简单的关系。把它们联系起来的一个、甚至是唯一容许的假设，是相同体积中所有气体的分子数目相等”。这样就可以使气体的原子量、分子量以及分子组成的测定与物理上、化学上已获得的定律完全一致。阿佛加德罗的这一假说，后来被称为阿佛加德罗定律。
阿佛加德罗还根据他的这条定律详细研究了测定分子量和原子量的方法，但他的方法长期不为人们所接受，这是由于当时科学界还不能区分分子和原子，分子假说很难被人理解，再加上当时的化学权威们拒绝接受分子假说的观点，致使他的假说默默无闻地被搁置了半个世纪之久，这无疑是科学史上的一大遗憾。直到1860年，意大利化学家坎尼扎罗在一次国际化学会议上慷慨陈词，声言他的本国人阿佛加德罗在半个世纪以前已经解决了确定原子量的问题。坎尼扎罗以充分的论据、清晰的条理、易懂的方法，很快使大多数化学家相信阿化加德罗的学说是普遍正确的。但这时阿佛加德罗已经在几年前默默地死去了，没能亲眼看到自己学说的胜利。
阿佛加德罗是第一个认识到物质由分子组成、分子由原子组成的人。他的分子假说奠定了原子一分子论的基础，推动了物理学、化学的发展，对近代科学产生了深远的影响。他的四卷著作《有重量的物体的物理学》（1837～1841年）是第一部关于分子物理学的教程。
