1907年11月13日，王应睐生于福建省金门县偏僻的山后社农村一个华侨家庭。父亲先后在日本神户，中国大连、营口经商。2岁时父亲逝世，6岁时母亲相继也去世。他4岁入公办私塾读书，11岁时随二哥、三哥进入鼓浪屿著名的英国教会办的英华书院上学。由于他的聪颖与努力，6年半就读完了9年的课程，于1925年提前毕业，时年仅17岁。接着进入福建协和大学。大学一年级时他对化学产生兴趣，但协和化学课程较少，而金陵大学化学系课程较多，他便于1926年转入南京金陵大学攻读化学，1929年以优异的成绩毕业，并获得学校颁发的“金钥匙”奖。大学毕业后，王应睐在金陵大学任助教。
1925-1926年，福建协和大学（1952年并入福州大学）学习。
1926-1929年，金陵大学（1952年并入南京大学）毕业。
1929年，王应睐毕业于金陵大学留校工作，因工作繁忙等原因染上了肺结核，当时没有特效药死亡率很高，但是王应决定再次求学。他考取了剑桥大学博士，师从国际学术界享有盛名的凯林教授改学生物化学，在英国他还被卷入过一场比试。因为在中国农村进行过营养状况调查时，目睹现状，感到简易测定的重要性，研究出一种目测维生素B的新方法，而专门研究维生素B的牛津大学彼德斯教授很不服气，英国相关机关便组织了一次实际比试，实验证明彼德斯教授的测定仪器过程复杂，远不如王应睐的简易测定准确度高，让观者都信服了。
1933-1934年，燕京大学研究院研究生
1933年，他进了北平燕京大学化学研究生院，从事氯仿、甲苯对蛋白酶的作用以及豆浆与牛奶消化率的比较等研究。1934年他再一次病倒，被迫休养。
1933年，进入北京燕京大学研究生院化学学科部，从事氯仿、甲苯对蛋白酶的作用以及豆浆与牛奶消化率的比较等研究工作。1936年接受金陵大学的聘请，担任讲师。
1938年，他考取庚款留英，到英国剑桥大学攻读博士研究生，在LJ海里斯博士（Harris）指导下从事维生素研究。这是20世纪30年代生物化学领域中最前沿的一个学科研究方向。为了更好地了解维生素在新陈代谢中的作用以及维生素本身的新陈代谢过程，就需要有一个方便、准确、微量与专一的测定方法。王应睐选择了这方面的研究作为自己的研究目标。经过艰苦努力，认真钻研，反复实验，他优选了荧光测定法。他所建立的维生素B1的硫色素荧光测定法，能够简便准确地测定食品以及尿等生物样品中的维生素B1含量，对于缺少精密仪器的实验室起了重要的作用。在仅仅两年的时间里，王应睐完成了4种不同水溶性维生素微量测定法。在这个阶段，王应睐还建立了其他B族维生素的测定方法以及维生素C的电位滴定法。由于王应睐的成绩优异，在研究生毕业时，获得了免试攻读博士的待遇，并于1941年得到生化博士学位。
1938—1945年 英国剑桥大学进修，1941年获生物化学博士学位。
1941年，王应睐受聘于剑桥大学Dunn营养实验室，继续从事维生素研究。他和Moore在国际上首先发现合成的纯维生素A过量时有毒性，在英国生物化学杂志上发表了《维生素A过多症》一文，引起各国学者的重视。
1943年，王应睐到剑桥大学Molteno研究所，在国际著名生化学家D凯林教授(Keilin)领导下工作，对血红蛋白的研究取得了突出的成果。王应睐提供完整的实验证据，证明豆科植物根瘤中含有血红蛋白。这一发现有助于从生物化学的角度来解释生物进化学说，并且促进了对豆血红蛋白在根瘤固氮中的作用的深入研究。王应睐还提纯与结晶了寄生在马胃中的马蝇蛆的血红蛋白，并且研究了它的性质，阐明了在不同生活条件下血红蛋白的性质与功能的关系。这项工作也具有重要的理论价值。王应睐的上述成就得到凯林教授的高度评价，并一直为国外同行所引述。
1945年，王应睐决定立即回国，开展中国的生物化学事业，为祖国服务。凯林教授十分赞赏王应睐的爱国精神，支持他的决定。当时交通尚未完全正常，王应睐乘船取道印度回国，被南京中央大学医学院聘请为生化教授。
1945-1948年 任中央大学教授。
1948年，王应睐应林可胜和冯德培的邀请离开中央大学到上海的中央研究院医学研究所筹备处担任研究员，从事氨基酸代谢与维生素的关系及酶研究。
1950年，中国科学院生理生化研究所成立，王应睐担任该所的研究员兼副所长。50年代，王应睐对琥珀酸脱氢酶的分离纯化，辅基鉴定以及辅基与酶朊连接方式进行了系统的研究。琥珀酸脱氢酶是生物体呼吸链上一个重要组分，1950年他就观察到鼠肝组织中琥珀酸脱氢酶活力与核黄素的摄取量密切相关。但是这个酶与具有脂双层结构的线粒体膜结合得比较密切，难于溶解下来而提纯。经与邹承鲁、汪静英等反复实验，最后采用正丁醇抽提法，成功地把琥珀酸脱氢酶从线粒体膜上溶解下来，得到了高纯度的水溶性琥珀酸脱氢酶，而且其活力比同期国外报导者高出1倍以上。然后，王应睐和同事们对琥珀酸脱氢酶的性质又进行了深入的研究，证明它是一种含有异咯嗪腺嘌呤二核苷酸和非血色素铁的酶，酶的蛋白部分与异咯嗪腺嘌呤二核苷酸是以共价键结合的，在酶研究中，这是第一个被发现以共价键相结合的异咯嗪蛋白质。这项工作处于当时酶学研究的世界领先水平，1978年获全国科学大会重大科技成果奖。
1950年王应睐观察到鼠肝组织中琥珀酸脱氢酶活力与核黄素（异咯嗪）的摄取量密切相关，但要深入研究这个酶首先要解决酶的提纯。由于这个酶与具有脂双层结构的线粒体膜结合得比较紧密，很难溶解下来，所以提纯很不容易。针对这一特点，王应睐与邹承鲁、汪静英一起采用正丁醇抽提的方法，成功地把琥珀酸脱氢酶从膜上溶解下来，从而分离纯化得到高纯度的水溶性琥珀酸脱氢酶，其活力比同期国外报道者高出1倍以上。这一纯化方法至今仍为国外许多实验室所采用，只是稍加修改，在提取时不再加氰化钾而已。
他对这个酶的性质的研究也有重要的发现，提出了充分的证据证明它是一种含有异咯嗪腺嘌呤二核苷酸和非血色素铁的酶，酶的蛋白部分与异咯嗪腺嘌呤二核苷酶是以共价键结合的，这是在酶的研究中第一个发现的以共价键结合的异咯嗪蛋白质，它为以后呼吸链有关酶系的分离和重组合的研究开辟了道路。这项工作居当时酶学研究的世界领先水平。
1955年，在布鲁塞尔举行的第三届国际生化大会上，王应睐宣读了这一研究的论文，受到极高的评价。王应睐基础理论研究的造诣很深，但他也很重视联系实际的工作。上海解放初期，南下的解放军战士由于只吃大白菜、豆腐与大米，普遍发生舌头糜烂，下身奇痒与溃烂等症状。上海警备区特请临床营养学家侯祥川教授与王应睐前去会诊，很快就被确诊为维生素B2缺乏症。侯祥川对战士们进行治疗，王应睐则分析食品中维生素B2含量，提出有效的措施，很快就解决了问题。
抗美援朝时期我志愿军战士的主要食物是干粮，但是后方生产的干粮过不了多久就变质产生哈喇味，直接影响了部队的后勤供应与战斗力。王应睐接受了研究防止干粮脂肪氧化的任务，通过研究提出了切实可行的综合措施，包括利用含有天然抗氧化剂的黄豆粗豆油作为干粮的油脂来源，严格控制干粮中催化脂肪氧化的铜铁离子的含量，以及采用经防氧化处理的包装纸等，解决了问题。
1955年选聘为中国科学院院士。
1958年，中国科学院生理生化研究所划分为生理研究所和生物化学研究所两个研究所，王应睐被任命为中国科学院生物化学研究所所长。
1958—1984年 任中国科学院生物化学研究所（后改称上海生物化学研究所）研究员兼所长。
1963年，他担任人工合成胰岛素协作组组长，组织协调与中国科学院有机化学研究所、北京大学的合作，
1965年9月，王应睐领导中国科学家在世界上首次成功合成牛胰岛素。
1977年起，又挑起了整个科研工作的协作组组长的重担，在制定各单位分工，确定酶法合成与化学合成的关系等方面起了重要的作用。
1978年，协作组成立了RNA连接酶制备、长片段连接和活力测定三个研究组，大大加快了步伐，终于在1981年完成了世界上第一个人工合成的转移核糖核酸。
1978—1983年 任中国科学院上海分院和上海科学院院长。
1981年，王应睐领导中国科学家获得了世界上第一个人工合成的转移核糖核酸，人们以“中国生化先驱”赞誉王应睐，而目睹了十年间世界生化界飞速发展的王应睐，在接受采访时意味深长的说，我们就像一只老在打盹的兔子，而别人并不是乌龟，同年当选为比利时皇家科学文学与美术院外籍院士。
1984年春天，王应睐担任上海生物化学研究所名誉所长。他十分尊重并全力支持新任所长的工作。他是中国《生物化学与生物物理学报》的名誉主编，经常帮助审阅英文版稿件。他还担任了中国科学院上海生物工程基地专家委员会主任，为基地筹建提供了许多宝贵的意见
1984年，王应睐退居二线，担任上海生物化学研究所名誉所长，他还领导一个课题组，并亲自选定方向，对近年来国际上分子生物学中的前沿课题——酶与核酸的相互作用开展研究。在这项研究工作中，他放手让课题组的中青年科技骨干挑重担，建立技术和方法，设计研究路线，并且对氨酰——tRNA合成酶本身进行了深入的研究，采取化学修饰，限制性酶解和基因克隆等方法获得了一批较高水平的成果，具有重要的理论价值，达到了国际先进水平。
1987年，在王应睐的积极倡导下，召开了由中国生物化学学会组织的国际生化会议（IMB）。王应睐作为会议的主席，在确定大会报告人，邀请国外学者参加等工作中起了主导作用。IMB取得完全的成功为中国生物化学界赢得了荣誉，这是与王应睐的辛勤努力分不开的，作为国际上知名的科学家，
1984—2001年 任中国科学院上海生物化学研究所研究员兼名誉所长。
1985年春节前夕，中国科学院上海分院隆重举行“老科学家从事科学工作50年”表彰庆贺活动，向中国科学院上海各研究所20位驰名科坛，功绩卓越的老科学家致以热烈祝贺和崇高敬意。人们以“中国生化先驱”赞誉王应睐。会上王应睐即席发言，他引用“往者不可谏，来者犹可追”的格言自勉，表达了他耄耄之年，壮心不已，为发展中国生化事业矢志不渝的一片赤诚。
1988年2月，在美国佛罗里达州迈阿密生物技术冬季讨论会上，王应睐被授予“特殊成就奖”。这是为了表彰他领导中国科学家在人工合成生物高分子方面所取得的成绩而特设的一项奖励。在授奖仪式上，会议主席、迈阿密大学生化系主任韦伦教授向王应睐颁发了一块奖盾，上面镌刻着：王应睐从1958年至1984年任中国科学院上海生物化学研究所所长。在此期间他曾作为协作组组长完成两项杰出的、具有开创性的成果。一项是1965年人工合成胰岛素；另一项是1981年人工合成酵母丙氨酸转移核糖核酸。
2001年5月5日逝世于上海，享年93岁。
