怎么利用层析法纯化酶如何确定目的蛋白?

Question

如题所述

Answer 1

可以通过测定活力确定目的蛋白即可。

纯化蛋白最有效的就是亲和层析，是通过目的蛋白与相匹配的固定化配体的进行特异性结合，实现纯化目的。最显著的特点就是，良好表征的标签与其对应的固相偶联的配体的结合，能够对标记蛋白单步操作实现亲和纯化。

融合标签的抗体也被广泛用于下游检测和实验，从而无需针对每种特定重组蛋白去开发相应的探针。抗体纯化主要涉及从血清（多克隆抗体）、腹水和杂交瘤细胞系培养上清液（单克隆抗体）中选择性富集或特异性分离抗体。

层析法纯化酶介绍：

Protein
A，Protein G和Protein
L是三种细菌蛋白，因其与抗体的高效结合而被大家所熟知。这些蛋白经过基因工程编辑重组表达，通常用于从各种不同物种中进行关键抗体类型的亲和纯化。

动脉硬化症、高血脂及糖尿病等。鉴于α淀粉酶抑制剂的重要生物学功能，许多学者对不同来源的α淀粉酶抑制剂结构、理化特性以及药理作用进行了研究。

Answer 2

一、利用层析法纯化酶
层析法基于酶与某种固定相之间的特定相互作用进行分离。以下是利用不同类型的层析法纯化酶的基本步骤：
1.制备样品:
将含有目标酶的细胞或组织进行裂解，得到原始的细胞抽提物。
通常会用超声、高压均质或其他方法裂解细胞。
通过离心去除裂解后的细胞碎片和未破碎的细胞。

2.初步纯化:
使用沉淀法（如硫酸铵沉淀）从细胞抽提物中分离大部分的蛋白质，得到粗酶制剂。
3.凝胶渗透层析 (Gel filtration chromatography):
基于分子大小进行分离。较大的分子首先通过柱子，而较小的分子被凝胶珠子延迟。
4.离子交换层析 (Ion exchange chromatography):
利用蛋白质的表面带电性进行分离。蛋白质会与柱子上带有反电荷的固定相结合，然后通过逐渐改变盐浓度或pH值来洗脱目标酶。
5.亲和层析 (Affinity chromatography):
这是一种特异性极高的纯化方法，适用于已知与某特定配体结合的酶。
将这种配体固定到柱子上，然后通过与目标酶特异性的结合和洗脱来进行纯化。例如，对于与某特定底物结合的酶，可以将该底物或其类似物固定到柱子上作为亲和配体。

6.水合作用层析 (Hydrophobic interaction chromatography):
基于蛋白质表面的疏水性区域进行分离。首先增加盐浓度使蛋白质表面的疏水区域暴露出来，然后通过降低盐浓度来洗脱目标酶。
7.洗脱与浓缩:
从层析柱中洗脱后，根据需要使用超滤或其他方法对酶解进行浓缩。
8.验证纯化效果:
使用SDS-PAGE、活性测定和其他方法验证酶的纯度和活性。
二、确定目的蛋白：
确定目的蛋白通常涉及在一组蛋白或细胞样品中检测、定量和验证特定蛋白质的存在。
1.样品准备
使用SDS-PAGE将细胞或组织抽提物中的蛋白进行分离。根据预期的目的蛋白分子量观察是否有相应大小的蛋白质条带。
2.蛋白鉴定
1）Western Blot:
使用SDS-PAGE分离蛋白后，将其转移到PVDF或nitrocellulose膜上。使用针对目的蛋白的特异性抗体进行检测。如果目的蛋白存在，则会观察到相应大小的条带。
2）免疫沉淀或亲和纯化:
如果有针对目的蛋白的特异性抗体或已知其结合伙伴，可以使用免疫沉淀或亲和纯化来从细胞或组织样品中提取目的蛋白。
3）免疫细胞化学或免疫荧光染色:
在细胞或组织切片上使用特异性抗体来直接检测目的蛋白的存在和定位。
4）蛋白质质谱分析:
在SDS-PAGE上分离目的蛋白后，从凝胶中切取相应的蛋白质条带。
通过酶消化和质谱分析获得蛋白质的肽段指纹。
使用数据库搜索软件，如Mascot、Sequest或MaxQuant等，对肽段指纹进行匹配，确认蛋白质的身份。

3.功能性验证:
对目的蛋白进行功能性实验，例如酶活性测定、结合测定或生物活性测定，以进一步验证蛋白质的身份。
确定目的蛋白时，最好使用多种方法并结合多个实验数据来验证蛋白质的存在和纯度，以确保结果的准确性和可靠性。本回答被网友采纳