青霉素是B-内酰胺抗生素，在细胞繁殖期起杀菌作用。
青霉素作用机制是干扰细菌
细胞壁的合成。
青霉素通过抑制细菌细胞壁四肽侧链和五肽交连桥的结合而阻碍细胞壁合成而发挥杀菌作用。青霉素的结构与细胞壁的成分粘肽结构中的D-丙氨酰-D-丙氨酸近似，可与后者竞争转肽酶，阻碍粘肽的形成，造成细胞壁的缺损，使细菌失去细胞壁的渗透屏障，对细菌起到杀灭作用。
其对革兰阳性菌有效，由于革兰阴性菌缺乏五肽交连桥而青霉素对其作用不大。
青霉素对溶血性链球菌等链球菌属，肺炎链球菌和不产青霉素酶的葡萄球菌具有良好抗菌作用。对肠球菌有中等度抗菌作用，淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、白喉棒状杆菌、炭疽芽孢杆菌、牛型放线菌、念珠状链杆菌、
李斯特菌、钩端螺旋体和梅毒螺旋体对本品敏感。本品对流感嗜血杆菌和
百日咳鲍特氏菌亦具一定抗菌活性，其他革兰阴性需氧或兼性
厌氧菌对本品敏感性差.本品对梭状芽孢杆菌属、消化链球菌、厌氧菌以及产
黑色素拟杆菌等具良好抗菌作用，对脆弱拟杆菌的抗菌作用差。