如何检测补体的存在

Question

如题所述

Answer 1

补体测定
第一节 补体的性质与活化途径
一、补体的性质
补体（complement，C）：是一组存在于人和脊椎动物(vertebrates)血清及组织液中具有酶样活性、不耐热和功能上连续反应的糖蛋白，是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件，故称为补体。
补体系统的功能：
广泛参与机体的抗感染防御反应，
介导细胞溶解，
调理吞噬，
免疫黏附，
参与炎症反应引起机体免疫损伤等
补体按其性质与功能分为三类,即
• ①补体系统的固有成分,共9种,按先后次序分别命名为C1-C9 ②调节和控制补体系统活化的成分,多以其功能命名,如C1抑制物
③补体受体(CR),以其结合对象来命名
二、补体的活化途径
经典途径
替代途径
MBL途径
（一）补体激活的经典途径
是以IgG（1，2，3）或IgM类抗体结合抗原后的免疫复合物为主要激活剂，激活过程从C1q开始，补体C1~C9共11种成分全部参与的活化途径。
二）补体激活的替代途径
补体激活的替代途径又称旁路途径，与经典途径不同之处在于激活与抗原体复合物
无关，是非特异性的，没有c1，c4和c2参与，直接激活c3，完成c5~c9的激活过程
血清总补体活性测定（CH50试验）
（一）实验原理
补体最主要的活性是溶细胞作用，这种活性很容易通过溶血反应进行检测。在一个适当的、稳定的反应系统中，溶血反应对补体的剂量依赖呈一个特殊的S形曲线。在轻微溶血和接近完全溶血时，补体量的变化不能使溶血程度有显著改变，即溶血对补体量的变化不敏感。但在半溶血（50％溶血）上下时曲线最陡，即使补体含量仅有较小变动时，溶血程度也会发生较大的改变，也就是说对补体量的变化非常敏感。故采用50％溶血作为终点指标要比100％溶血敏感得多，这一方法称为补体50％溶血（complement hemolysis 50％），简称为CH50。
二)试验方法
1、绵羊RBC：浓度一般为2%~5%
2、溶血素：即抗绵羊RBC抗体，试验前应在56℃加热30min或60 ℃加热30min以灭活补体
3、稀释缓冲液：磷酸缓冲液或巴比妥缓冲液
4、50%溶血标准管：
5、取新鲜血清标本进行试验。按的要求在各管中加入试剂和反应物，一起放37℃水浴箱中温育30min。
温育后将所有试管2500r/min离心5min，通过观察比较，选择溶血程度与标准管相近的两管在分光光度计上分别读取吸光度，以最接近标准管的那一管定为最高有效反应管，取其稀释倍数代入下列公式，求得CH50的测定值（单位U）。
每毫升血清总补体活性（单位）＝ 1/血清用量×稀释倍数
三）方法评价
CH50试验测定的是经典途径总补体溶血活性，所反应的是补体9种成分的综合水平。 方法简便、快速，但敏感性低，补体的溶血活性除与试验中反应体积成反比外，还与反应所用缓冲液的pH、离子强度、钙镁浓度、SRBC数量和反应温度有一定关系。
钙镁离子可稳定溶血系统，但过量反而抑制溶血反应。
单个补体成分的测定
一、免疫溶血法
二、免疫化学法
补体结合试验
　　补体结合试验（complement fixation test，CFT）是用免疫溶血机制做指示系统，来检测另一反应系统抗原或抗体的试验。早在1906年Wasermann就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反应。 这一传统的试验经不断改进，除了用于传染病诊断和流行病学调查以外，在一些自身抗体、肿瘤相关以原以及HLA的检测和分析中也有应用。
一、试验原理
该试验中有5种成分参与反应，分属于3个系统： ①反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）；
②补体系统；
③指示系统，即SRBC与相应溶血素，试验时常将其预先结合在一起，形成致敏红细胞。 反应系统与指示系统争夺补体系统，先加入反应系统给其以优先结合补体的机会。
二、试验方法
　　补体结合试验的改良方法较多，较常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法（塑板法）等。目前以后两种方法应用较为广泛，因为可以节省抗原，血清标本用量较少，特异性也较好。以下叙述以小量法为例，即抗原、抗体、溶血素、羊红细胞各加0.1ml，补体加0.2ml，总量为0.6ml。
（一）试剂
1．抗原：试验中用于检测抗体的抗原应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强。如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应。 2．抗原和抗本的滴定：补体结合试验中，抗原与抗体按一定比例结合，因而应通过试验选择适宜的浓度比例。多采用方阵法进行滴定，选择抗原与抗体两者都呈强阳性反应（100％不溶血）的最高稀释度作为抗原和抗体的效价（单位）。
3、补体的滴定：一般用豚鼠补体，补体滴定9逐步加入各试剂，温育后观察最少量补体能产生完全溶血者，确定为1个实用单位，正式试验中使用2个实用单位。
（二）血清标本
　　采集血液标本后及时分离血清，及时检验或将血清保存于－20℃。血清在试验前应先加热56℃30min（或60℃3min）以破坏补体和除去一些非特异因素。
血清标本遇有抗补本现象时可做下列处理之一：①加热提高12 ℃ ；
②－20℃冻融后离心去沉淀；
③以3mmol/L盐酸处理；
④加入少量补体后再加热灭活；
⑤以白陶土处理；
⑥通入CO2；
⑦以小白鼠肝粉处理；
⑧用含10％新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释补体。
（三）正式试验
　　以小量法测定抗体的补体结合试验为例。逐步加入各种试剂，温育后先观察各类对照管，应与预期的结果吻合。
三、方法评价
　　补体结合试验是一种传统的免疫学技术，能够沿用至今说明它本身有一定的优点：①灵敏度高。补体活化过程有放大作用，比沉淀反应和凝集反应的灵敏度高得多，能测定0.05μg/ml的抗体，可与间接凝集法的灵敏度相当。②特异性强。各种反应成分事先都经过滴定，选择了最佳比例，出现交叉反应的机率较小，尤其用小量法或微量法时。③应用面广，可用于检测多种类型的抗原或抗体。④易于普及，试验结果显而易见；试验条件要求低，不需要特殊仪器或只用光电比色计即可。