用紫外光光度测定蛋白质含量
引用：
6种测定蛋白质含量
、微量凯氏（kjeldahl）定氮
品与浓硫酸共热含氮机物即解产氨（消化）氨与硫酸作用变硫酸氨经强碱碱化使解放氨借蒸汽氨蒸至酸液根据酸液程度计算品氮含量若甘氨酸例其反应式：
nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1)
2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2)
(nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3)
反应（1）、(2)凯氏瓶内完反应（3）凯氏蒸馏装置进行
加速消化加入cuso4作催化剂k2so4提高溶液沸点收集氨用硼酸溶液滴定则用强酸实验计算略
计算所结品总氮量欲求 品蛋白含量应总氮量减非蛋白
氮即欲进步求品蛋白质含量即用品蛋白氮乘6．25即
二、双缩脲（biuret）
（）实验原理
双缩脲（nh3conhconh3）两脲经180℃左右加热放氨产物强碱性溶液双缩脲与cuso4形紫色络合物称双缩脲反应凡具两酰胺基或两直接连接肽键或能间碳原相连肽键类化合物都双缩脲反应
紫色络合物颜色深浅与蛋白质浓度比与蛋白质量及氨基酸关故用测定蛋白质含量测定范围1-10mg蛋白质干扰测定物质主要：硫酸铵、tris缓冲液某些氨基酸等
优点较快速 同蛋白质产颜色深浅相近及干扰物质少主要缺点灵敏度差双缩脲用于需要快速并需要十精确蛋白质测定
（二）试剂与器材
1. 试剂：
（1）标准蛋白质溶液：用标准结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白配制10mg/ml标准蛋白溶液用bsa浓度1mg/mla2800.66校其纯度需要标准蛋白质预先用微量凯氏定氮测定蛋白氮含量计算其纯度再根据其纯度称量配制标准蛋白质溶液牛血清清蛋白用h2o 或0.9%nacl配制酪蛋白用0．05n naoh配制
（2）双缩脲试剂：称1.50克硫酸铜（cuso4?5h2o）6.0克酒石酸钾钠（knac4h4o6?4h2o）用500毫升水溶解搅拌加入300毫升10% naoh溶液用水稀释1升贮存于塑料瓶（或内壁涂石蜡瓶）试剂期保存若贮存瓶黑色沉淀现则需要重新配制
2. 器材：
见光光光度计、试管15支、旋涡混合器等
（三）操作
1. 标准曲线测定：取12支试管两组别加入00.20.40.60.81.0毫升标准蛋白质溶液用水补足1毫升加入4毫升双缩脲试剂充摇匀室温（20～25℃）放置30钟于540nm处进行比色测定用未加蛋白质溶液第支试管作空白照液取两组测定平均值蛋白质含量横座标光吸收值纵座标绘制标准曲线
2、品测定：取2～3试管用述同测定未知品蛋白质浓度注意品浓度要超10mg/ml
三、folin—酚试剂（lowry）
（）实验原理
种蛋白质测定灵敏应用广泛种由于其试剂乙配制较困难（现已订购）近逐渐考马斯亮兰所取代显色原理与双缩脲相同加入第二种试剂即folin—酚试剂增加显色量提高检测蛋白质灵敏度两种显色反应产深兰色原：碱性条件蛋白质肽键与铜结合复合物folin—酚试剂磷钼酸盐—磷钨酸盐蛋白质酪氨酸苯丙氨酸残基原产深兰色（钼兰钨兰混合物）定条件兰色深度与蛋白量比
folin—酚试剂早由lowry确定蛋白质浓度测定基本步骤物化领域广泛应用测定优点灵敏度高比双缩脲灵敏缺点费间较要精确控制操作间标准曲线严格直线形式且专性较差干扰物质较双缩脲反应发干扰离同容易干扰lowry反应且者影响要酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均干扰作用浓度较低尿素（0.5%）硫酸纳（1%）硝酸纳（1%）三氯乙酸（0.5%）乙醇（5%）乙醚（5%）丙酮（0.5%）等溶液显色影响些物质浓度高必须作校曲线含硫酸铵溶液须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液即显色测定若品酸度较高显色色浅则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液浓度1～2倍
进行测定加folin—酚试剂要特别该试剂仅酸性ph条件稳定述原反应ph=10情况发故folin酚试剂加碱性铜—蛋白质溶液必须立即混匀便磷钼酸—磷钨酸试剂破坏前原反应即能发
适用于酪氨酸色氨酸定量测定
检测低蛋白质量达5mg通测定范围20~250mg
（二）试剂与器材
1.试剂
（1）试剂甲：
（a）10克 na2co32克 naoh0.25克酒石酸钾钠 （knac4h4o6?4h2o）溶解于500毫升蒸馏水
（b）0.5克硫酸铜（cuso4?5h2o）溶解于100毫升蒸馏水每使用前50份（a）与1份（b）混合即试剂甲
（2）试剂乙：2升磨口流瓶加入100克钨酸钠（na2wo4?2h2o）,25克钼酸钠（na2moo4?2h2o）及700毫升蒸馏水再加50毫升85%磷酸100毫升浓盐酸充混合接流管火流10流结束加入150克硫 酸 锂（li2so4）50毫升蒸馏水及数滴液体溴口继续沸腾15钟便驱除量溴冷却溶液呈黄色（仍呈绿色须再重复滴加液体溴步骤）稀释至1升滤滤液置于棕色试剂瓶保存使用用标准naoh滴定酚酞作指示剂适稀释约加水1倍使终酸浓度1n左右
（3）标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白溶于蒸馏水浓度250mg/ml左右牛血清清蛋白溶于水若混浊改用0.9%nacl溶液
2. 器材
（1）见光光光度计
（2）旋涡混合器
（3）秒表
（4）试管16支
（三）操作
1. 标准曲线测定：取16支试管1支作空白3支留作未知品其余试管两组别加入00.10.20.40.60.81.0毫升标准蛋白质溶液（浓度250mg/ml）用水补足1.0毫升每支试管加入5毫升试剂甲旋涡混合器迅速混合于室温（20～25℃）放置10钟再逐管加入0.5毫升试剂乙（folin—酚试剂）同立即混匀步混合速度要快否则使显色程度减弱室温放置30钟未加蛋白质溶液第支试管作空白照于700nm处测定各管溶液吸光度值蛋白质量横座标吸光度值纵座标绘制标准曲线
注意：lowry反应显色随间断加深各项操作必须精确控制间即第1支试管加入5毫升试剂甲始计1钟第2支试管加入5毫升试剂甲2钟加第3支试管余类推全部试管加完试剂甲若已超10钟则第1支试管立即加入0.5毫升试剂乙1钟第2支试管加入0.5毫升试剂乙2钟加第3支试管余类推待支试管加完试剂再放置30钟始测定光吸收每钟测品
进行试管操作防止错每位都必须实验记录本预先画面表格表每试管要加入量（毫升）并按由左至右由至顺序逐管加入面两排计算每管蛋白质量（微克）测吸光度值
folin—酚试剂实验表
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
（250mg/ml）
未知蛋白质 0.2 0.4 0.6
（约250mg/ml）
蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4
试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
每管蛋白质量（mg）
吸光度值（a700）
2. 品测定：取1毫升品溶液（其约含蛋白质20~250微克）按述进行操作取1毫升蒸馏水代替品作空白照通品测定与标准曲线测定放起同进行即标准曲线测定各试管面再增加3试管表8、9、10试管
根据所测品吸光度值标准曲线查相应蛋白质量计算品溶液蛋白质浓度
注意:由于各种蛋白质含同量酪氨酸苯丙氨酸显色深浅往往随同蛋白质变化本测定通适用于测定蛋白质相浓度（相于标准蛋白质）
四、改良简易folin—酚试剂
（）试剂
1. 试剂甲：碱性铜试剂溶液含0.5n naoh、10%na2co3、0.1%酒石酸钾0.05%硫酸铜配制注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解加入2. 试剂乙：与前面基本相同临用加蒸馏水稀释8倍
3. 标准蛋白质溶液：同基本
（二）操作步骤
测定标准曲线与品溶液操作与基本相同试剂甲改1毫升室温放置10钟试剂乙改4毫升55℃恒温水浴保温5钟用流水冷却660nm测定其吸光度值
改良快速简易获与 folin—酚试剂（即lowry基本）相接近结
五、考马斯亮兰（bradford）
（）实验原理
双缩脲（biuret）folin—酚试剂（lowry）明显缺点许限制促使科家寻找更蛋白质溶液测定
1976由bradford建立考马斯亮兰（bradford）根据蛋白质与染料相结合原理设计种蛋白质测定具超其几种突优点广泛应用目前灵敏度高蛋白质测定
考马斯亮兰g-250染料酸性溶液与蛋白质结合使染料吸收峰位置（lmax）由465nm变595nm溶液颜色由棕黑色变兰色经研究认染料主要与蛋白质碱性氨基酸（特别精氨酸）芳香族氨基酸残基相结合
595nm测定吸光度值a595与蛋白质浓度比
bradford突优点：
（1）灵敏度高据估计比lowry约高四倍其低蛋白质检测量达1mg蛋白质与染料结合产颜色变化蛋白质－染料复合物更高消光系数光吸收值随蛋白质浓度变化比lowry要
（2）测定快速、简便需加种试剂完品测定需要5钟左右由于染料与蛋白质结合程约要2钟即完其颜色1内保持稳定且5钟至20钟间颜色稳定性完全用像lowry费严格控制间
（3）干扰物质少干扰lowryk+、na+、mg2+离、tris缓冲液、糖蔗糖、甘油、巯基乙醇、edta等均干扰测定
缺点：
（1）由于各种蛋白质精氨酸芳香族氨基酸含量同bradford用于同蛋白质测定较偏差制作标准曲线通选用 g—球蛋白标准蛋白质减少面偏差
（2）仍些物质干扰测定主要干扰物质：污剂、 triton x-100、十二烷基硫酸钠（sds）0.1nnaoh（同0.1n酸干扰lowary）
（3）标准曲线轻微非线性能用beer定律进行计算能用标准曲线测定未知蛋白质浓度
（二）试剂与器材
1. 试剂：
（1）标准蛋白质溶液用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(bsa)配制1.0mg/ml0.1mg/ml标准蛋白质溶液
（2）考马斯亮兰g—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰g—250溶于50ml 95%乙醇再加入120ml 85%磷酸用水稀释至1升
2. 器材：
（1）见光光光度计
（2）旋涡混合器
（3）试管16支
（三）操作
1. 标准
（1）取16支试管1支作空白3支留作未知品其余试管两组按表顺序别加入品、水试剂即用1.0mg/ml标准蛋白质溶液给各试管别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml用离水补充0.1ml各试管别加入5.0ml考马斯亮兰g—250试剂每加完管立即旋涡混合器混合（注意要太剧烈免产量气泡难于消除）未知品加量见表第8、9、10管
（2）加完试剂2-5钟即始用比色皿光光度计测定各品595nm处光吸收值a595空白照第1号试管即0.1mlh2o加5.0mlg—250试剂
注意：使用石英比色皿（易洗染色）用塑料或玻璃比色皿使用立即用少量95%乙醇荡洗洗染色塑料比色皿决用乙醇或丙酮间浸泡
考马斯亮兰实验表
管 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
(1.0mg/ml)
未知蛋白质 0.02 0.04 0.06
(约1.0mg/ml)
蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04
考马斯亮蓝
g－250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
每管蛋
白质量（mg）
光吸收值
（a595）
（3）用标准蛋白质量（mg）横座标用吸光度值a595纵座标作图即条标准曲线由标准曲线根据测未知品a595值即查未知品蛋白质含量
0.5mg牛血清蛋白/ml溶液a595约0.50
2. 微量
品蛋白质浓度较稀（10－100mg/ml）,取量（包括补加水）加0.5ml或1.0ml, 空白照则别0.5ml或1.0ml h2o, 考马斯亮蓝g－250试剂仍加5.0ml, 同作相应标准曲线测定595nm光吸收值
0.05mg牛血清蛋白/ml溶液a595约0.29
六、紫外吸收
蛋白质酪氨酸、苯丙氨酸色氨酸残基苯环含共轭双键使蛋白质具吸收紫外光性质吸收高峰280nm处其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量比外蛋白质溶液238nm光吸收值与肽键含量比利用定波蛋白质溶液光吸收值与蛋白质浓度比关系进行蛋白质含量测定
紫外吸收简便、灵敏、快速消耗品测定仍能收使用低浓度盐例化制备用（nh4）2so4等数缓冲液干扰测定特别适用于柱层析洗脱液快速连续检测需测定蛋白质浓度变化需知道其绝值
特点测定蛋白质含量准确度较差干扰物质用标准曲线测定蛋白质含量些与标准蛋白质酪氨酸色氨酸含量差异蛋白质定误差故该适于用测定与标准蛋白质氨基酸组相似蛋白质若品含嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光物质现较干扰核酸干扰通查校表再进行计算加适校同蛋白质核酸紫外吸收相同虽经校测定结存定误差
外进行紫外吸收测定由于蛋白质吸收高峰ph改变变化要注意溶液ph值测定品ph要与测定标准曲线ph相致
面介绍四种紫外吸收：
1. 280nm光吸收
蛋白质酪氨酸、苯丙氨酸色氨酸280nm处具吸收且各种蛋白质三种氨基酸含量差别测定蛋白质溶液280nm处吸光度值用紫外吸收
测定待测蛋白质溶液倒入石英比色皿用配制蛋白质溶液溶剂（水或缓冲液）作空白照紫外光度计直接读取280nm吸光度值a280蛋白质浓度控制0.1～1.0mg/ml左右通用1cm光径标准石英比色皿盛浓度1mg/ml蛋白质溶液a280约1.0左右由立即计算蛋白质致浓度
许蛋白质定浓度定波光吸收值（a1％1cm）文献数据查根据光吸收值较准确计算蛋白质浓度式列蛋白质浓度与（a1％1cm）值（即蛋白质溶液浓度1%光径1cm光吸收值）关系文献值a1％1cm,?称百吸收系数或比吸收系数
蛋白质浓度 = (a280′10 )/ a1％1cm,280nm (mg/ml)
(q 1%浓度?10mg/ml)
例：牛血清清蛋白 ： a1％1cm=6.3 (280nm)
溶菌酶 ： a1％1cm=22.8 (280nm)
若查待测蛋白质a1％1cm值则选用种与待测蛋白质酪氨酸色氨酸含量相近蛋白质作标准蛋白质用标准曲线进行测定标准蛋白质溶液配制浓度1.0mg/ml用标准蛋白质牛血清清蛋白（bsa）
标准曲线测定：取6支试管按表编号并加入试剂：
管号 1 2 3 4 5 6
bsa（1.0mg/ml） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
h2o 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0
a280
用第1管空白照各管溶液混匀紫外光光度计测定吸光度a280a280纵座标各管蛋白质浓度或蛋白质量（mg）横座标作图标准曲线应直线利用标准曲线根据测未知品a280值即查未知品蛋白质含量用2至6管a280值与相应试管蛋白质浓度计算该蛋白质a1％1cm,280nm
2. 280nm260nm吸收差
核酸紫外光强吸收280nm处吸收比蛋白质强10倍（每克）核酸260nm处吸收更强其吸收高峰260nm附近核酸260nm处消光系数280nm处2倍蛋白质则相反280nm紫外吸收值于260nm吸收值通：
纯蛋白质光吸收比值：a280/a260 ? 1.8
纯核酸光吸收比值： a280/a260 ? 0.5
含核酸蛋白质溶液别测定其a280a260由吸收差值用面经验公式即算蛋白质浓度
蛋白质浓度(mg/ml)=1.45×a280－0.74×a260
经验公式通系列已知同浓度比例蛋白质（酵母烯醇化酶）核酸（酵母核酸）混合液所测定数据建立
3. 215nm与225nm吸收差
蛋白质稀溶液由于含量低能使用280nm光吸收测定用215nm与225nm吸收值差通标准曲线测定蛋白质稀溶液浓度
用已知浓度标准蛋白质配制20～100 mg/ml系列5.0ml蛋白质溶液别测定215nm225nm吸光度值并计算吸收差：
吸收差d= a215 －a225
吸收差d纵座标蛋白质浓度横座标绘标准曲线再测未知品吸收差即由标准曲线查未知品蛋白质浓度
本蛋白质浓度20~100mg/ml范围内蛋白质浓度与吸光度比nacl、（nh4）2so4及0.1m磷酸、硼酸tris等缓冲液都显著干扰作用0.1n naoh, 0.1m乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液215nm光吸收值较必须其浓度降0.005m才显著影响
4. 肽键测定
蛋白质溶液238nm处光吸收强弱与肽键少比用标准蛋白质溶液配制系列50～500mg/ml已知浓度5.0ml蛋白质溶液测定238nm光吸收值a238a238纵座标, 蛋白质含量横座标绘制标准曲线未知品浓度即由标准曲线求
进行蛋白质溶液柱层析离洗脱液用238nm检测蛋白质峰位
本比280nm吸收灵敏种机物醇、酮、醛、醚、机酸、酰胺类氧化物等都干扰作用所用机盐机碱水溶液进行测定若含机溶剂先品蒸干或用其除干扰物质用水、稀酸稀碱溶解再作测定
感觉这样的提问没有什么意义
不要多想，想多了累
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