蓝白斑筛选重组子时首先是氨苄筛选,其次是半乳糖苷酶活性筛选。感受态细胞中应该也有质粒,而且应该也有氨苄抗性标记,而且感受态如DH5α的半乳糖苷酶应该是失活的,那么它也不能降解X-gal,与重组子一样的啊,那么怎么保证筛选到的是重组子呢?难道感受态中没有质粒吗?如果没有制备感受态的步骤中怎么没有提到呢?晕死了!!!
分子克隆中明确表示氨苄筛选在蓝白斑筛选中的共同作用,你的回答我不认可!我关心的是感受态到底有无质粒,如果有质粒那么质粒是否携带抗性标记?
追答希望这个问题你能自己考虑一下。野生菌通常都有质粒,在制备感受态、表达外源基因的过程中,是否有去掉原质粒的必要性,我可以明确告诉你现在有技术可以人工合成没有质粒的微生物,但关键是有没有必要。
关于氨苄筛选,我手上几篇关于重组的文章中,重组体系的构建只有空白对照中没有氨苄,阴性对照也加了,而且没有关于氨苄的阳性对照组(不加入X-gal),觉得可以排除氨苄为控制变量的可能,因而也就不存在氨苄筛选。在实验结果里,空白对照组有明显染菌现象。基本上可以认为氨苄的主要作用是防止染菌。另外,对于一个重组的工程菌,有可以完全筛选的蓝白斑筛选,为什么还有加入一个只能部分(甚至部分也不能)筛选的氨苄筛选。
如果这些问题你不愿意思考,实验不做也罢。而且你这种问问题的态度吗,以后爱问谁问谁!
我的意思是,氨苄确实可以抑制没有转入外源质粒的菌体的生长。氨苄一方面防止染菌,另一方面也有筛选的作用,这个不能否定。如果没有转入外源质粒的菌体可以生长的话,那么肯定干扰了重组子的筛选,因为它也是白斑。
追答我记得我们boss有一次问我细胞培养是氨苄的作用和不足,加入氨苄后,有时无法发现细胞液染菌。而且我做实验的过程中确实有加入氨苄仍然有杂菌生长的现象,不可排除突变体的出现,而且在氨苄阳性的培养基中,氨苄抗性的突变体的出现合情合理。刚才查了下我用过的几个感受态,都是敲出内切酶和甲基化酶的修饰菌体,应该还是有质粒的,可能也会还有抗性基因。所以觉得氨苄的筛选作用较小,更多的筛选还是应该通过蓝白斑,其实这个筛选也没有什么过于明确的原则,只要找出重组子就好了。做实验过程中你也发现了,凡是涉及到培养的,都会氨苄、庆大霉素之类的抗生素存在,或者其他一些很苛刻的培养条件限制
追问嗯,是的,加双抗培养细胞。我搜了其他论坛,上面说感受态没有质粒。应该是这样的,也没有必要就这个问题再钻了。还是采纳你吧!
本回答被提问者采纳我搜了其他论坛,上面说感受态没有质粒。