微生物计数方法有哪些？我想知道详细的操作步骤

Question

如题所述

Answer 1

微生物的显微直接计数法

一、实验目的
了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。
二、实验原理
测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。
显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。
血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图21-1），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。
使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
已知：1mm3体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3
所以：1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，即系数K=4×106 。
因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d）
三、实验器材
1．活材料：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培养液。
2．器材：显微镜、血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。
四、实验方法
1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10-2），以每小格的菌数可数为度。
2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。
3．将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。4．静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。
5．计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
6．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N），按公式计算出每ml（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。
7．测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。
五、实验作业：
将实验结果填入下表中：
计数次数 每个大方格菌数 稀 释
倍 数 试管斜面中的总菌数 平均值
1 2 3 4 5
第一次
第二次

Answer 2

好像很多种，最常用的是稀释观察本回答被提问者采纳

Answer 3

微生物i计数方法食品中微生物的菌落总数一般是指在被检样品的单位质量(g)、容积(mL)或表面积(cra’)内，所含能于某种固体培养基上，在一定条件下培养后生长的细菌菌落的总数。
食品有可能被多种微生物所污染，每种细菌都有一定的生活特性，培养时需满足其不同的营养条件及其生理条件(如温度、培养时间、pH值、需氧性质等)的要求，才能分别将各种细菌培养出来。但在食品的卫生检验中，一般都只用一种常用的方法去做菌落总数的测定，所得结果只包括一群能在普通营养琼脂中发育、嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。食品中需氧菌的计数和检测的方法有很多，包括
菌落计数方法、滤膜法、最近似值(MPN)计数法、染色剂褪色法及电测量方法等。
其中应用最为广泛的是菌落计数法，尤其是倾注平板计数法。平板计数与其他计数方法相比，能直接得到所需的数据，但菌落计数方法很难得到真实的菌体数。食品中菌落总数的测定，目的在于了解食品在生产中，从原料加工到成品包装受外界污染的情况，也可以应用这一方法观测食品中细菌的性质以及细菌在食品中繁殖的动态+，以便对被检样品进行卫生学评价时提供科学依据。
1．1倾注平皿法
1．1．1检样的制备和稀释微生物检样的过程必须保证无菌操作，需在无菌室或超净工作台内进行。制备样品时，带有包装的样品在廾启前需经一定的处理，塑料袋包装应先用蘸有75％酒精的棉球涂擦消毒袋口；容器包装应先用温水洗净表面，再用点燃的酒精棉球消毒开启部位及周围。取样时根据检验目的，而决定取样的部位。若为了判断质量鲜度；应多取内部肌肉；若为了检验污染程度或检索是否带有某种致病菌，应多在表层取样，或用棉拭采样法。检样所用的稀释剂主要有生理盐水、蒸馏水、磷酸盐缓冲液、o．1％蛋白胨水及林格氏液等。虽一般常采用灭菌生理盐水作稀释液，但以用磷酸盐缓冲液特别是o．1％蛋白胨水为合适，因蛋白胨水对细菌细胞有更好的保护作用，不会因为在稀释过程中而使检样中原已受损伤的细菌细胞导致死亡。AOAC规定用灭菌磷酸盐缓冲液，如样品是河流和海洋等的环境水样时，稀释液多采用高压灭菌或过滤灭菌的同样水。如果对含盐量较高的食品(如酱品等)进行稀释，则宜采用蒸馏水。具体相关的操作方法请参照SN0168—1992《出口食品平板菌落计数》或GB／T4789．2—2003((食品卫生微生物学检验菌落总数
1．1．2乎板接种与培养子板接种时，首先应将吸管直立使液体流出，并在平皿底干燥处擦吸管尖将余液排出；注入琼脂后立即往复摇动、顺时针转动、与第一次运动方向垂直摇动、逆时针转动共约5s—los，使培养基与接种物混合均匀，可保证样品充分分散，要防止把混合物溅到平皿壁和盖上。平板冷却后，不应长久放置，以免运动性强的菌株在琼脂表面蔓延生长。每个样品从稀释至倾注培养基的时间不得超过30min(一般为15min一30min)，因长时间放置可能会造成稀释液中悬浮的细菌死亡、增殖或菌落的分离，也可能会形成片状菌落。目前检测细菌总数时，采用到的培养基主要有营养琼脂和平板计数琼脂，国家标准采用营养琼脂，进出口商品检验行业标准和美国FDA细菌分析手册规定用乎板计数琼脂。加入平皿内的检样稀释液(特别是1．o+的稀释液)，有时带有食品颗粒，为避免与细菌菌落发生混淆，可在45℃左右的琼脂培养基中加入氯化三苯四氮唑(TTC)，因多数细菌生长时，能将五色的TTC还原为红色物质，所以培养后细菌变成红色菌落，而食品颗粒则不变色，从而很容易将二者分辨出来。TTC受热或光照易发生分解，配置好的溶液应放冷暗处保存。由于TTC在一定浓度下对革兰氏阳性菌有抑制作用，所以用之前应与不加TTC的做对照，以观测其对样品的计数有无不利影响。因样品污染的特殊性，有时加入TTC溶液后其计数结果可能会大幅度降低，故选用TTC一定要慎重。为了确定检验操作过程中是否受到来自空气的污染，可在进行检样的同时，打开一个琼脂平板暴露于工作台上，最后同时置于温箱培养。稀释液和培养基应做空白对照实验，即将琼脂培养基倾人加有lmL稀释液和未加稀释液的灭菌平皿内，随样品一同培养。有些食品带有颗粒，为避免与细菌菌落发生混淆，可做一检样稀释液与琼脂培养基混合的平皿，于4'C放置，在乎板计数时用做对照。培养条件应根据食品种类而定。肉、乳、蛋等食品一般均采用36'C土l℃，水产品兼受陆地细菌和海洋细菌的污染，水底温度较低，检验时细菌的培养温度应为30~C作为培养温度。其他食品，如清凉饮料、调味品、糖果、果脯、豆制品、酱腌菜等，均采用36*C土l℃培养48h土2h。
1．1．3菌落计数菌落计数所选择的稀释度，应保证平板菌落数在规定的范围内(就直径为90mm的平板而言)，30个一300个(如GB／T4789．2—2003)、25个一250个L真口SN0168—1992、FDA联细菌分析手册——需氧菌平板计数》(FDABacteriologicalAnalyticalManualAerobicPlateCount)]，或15个一300个(如ISO4833：1991~微生物学大肠杆菌菌落计数通用指南最大可能数技术》)等。当菌落数过多时，由于菌落过于拥挤或微生物体的拮抗作用而使菌落数目降低；当菌落数过低，则统计学错误将十分明显。菌落计数前先观测菌落生长的情况，一般同一稀释度的平板上的菌落数应相近，不同稀释度平板上的菌落数则应与稀释倍数成反比。蔓延菌落的生长会抑制其他菌株的生长，或者会覆盖其他的小菌落，所以最好不要选择有蔓延菌落生长的平板作为计数平板，但如必须选择，应在记录中标记清楚。如片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。平皿内如有链状菌落生长时(菌落之间无明显界限)，若只有一条链可视为一个菌落，如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。
其他计数方法
1．2．1平板表面涂布法该法是在凝固干燥后的琼脂平板上添加适量检样稀释液，立即用L型玻璃棒涂布均匀，进行培养即可。因使用的是凝固干燥后的琼脂平板，可使细菌免受融化琼脂的热力，不致因此而使部分细菌受损甚至不生长，从而避免了因操作中的不良因素而使样品中的菌落数有所降低。同时因菌落生长在乎板表面，便于识别和检查其形态，不会与食品颗粒发生混淆。所以此方法较倾注法为优，但因本法的取样量较少，将会对其代表性有所影响。
1．2．2螺旋平板计数仪螺旋平板计数仪适用于已知液体总量较少(液体样品或液体稀释液)的琼脂平板表面计数。平板经过常规培养后，很容易对螺旋轨迹部分的菌落进行计数，从而得到稀释液中的菌落数。该检测技术与传统的方法相比，检测结果在统计学上没有明显的差异，但可以减少稀释液体和倒平板等重复、繁琐的工作，大量节省了人力、减少了培养基和试剂的消耗，故FDA和AOAC先后于1992年和1995年已将其作为官方方法使用。
1．2．3陪替氏膜(PETRIFILM)平板法陪替氏膜平板法是AOAC—NMKL规定的方法，适用于所有类型的食品，也可用于表面的卫生检测。本法在计数食品中需氧微生物时使用可复水的干燥培养基制备的平板，30~C培养72h后计数菌落。由于培养基中四氮唑染料指示剂的浓度降低菌落会变红，每一个红点不管大小和颜色深浅都应做一个菌落计数。平板可叠成一摞放置，所以在培养或贮存中都很节省空间。
1．2．4滤膜法该方法是采用适当的压力使大量的液体样品或其稀释液快速通过，利用膜的微小孑L径
阻止细菌的通过。然后将滤膜夹到含有吸收垫的平皿中，吸收垫预先饱和地吸收了液体培养基，也可将膜贴在琼脂平板的表面，最后置培养箱培养。滤膜由一个多孔的醋酸纤维、硝酸纤维或混合纤维酯的圆形薄膜构成，膜上的毛细孔可以吸收营养液，并能将营养提供给细菌，使残留在滤膜表面的细菌培养后长成菌落。有时菌落的颜色和膜的颜色无明显反差，可对菌落或膜染色，以便准确计数。若样品可以大量通过滤膜，则该方法具有可以从大量样品中检测出少量的微生物的优点。
1．2．5最大可能数(MPN)计数法MPN值计数法是通过检查系列稀释液中菌体的增殖情况并测定活菌的比率来推断有活力的微生物的浓度，活菌的比率数能够显示菌种在适当的培养基中是否生长。一般选择三个连续的10倍稀释度进行试验，包括生长和阴性各占一半的稀释度，以及与该稀释度前后相邻的两个稀释度。记录这些试管中细菌的生长情况，对照相应的MPN值表就可得到样品的MPN值。当估计样品中细菌含量较低时(如<1个／mL)，采用该方法很有效，根据具体情况可选用双料培养基。
1．2．6电测量方法阻抗(电导)方法是一种快速检测技术，即可应用于微生物学的质量保证，也可应用于研究食品环境对微生物菌株的影响。该方法通过检测培养基中阻抗的减少来达到细菌检测的目的，阻抗的降低是由微生物的代谢和增殖造成的。该方法能够同时处理大批量样品，并能自动监视电阻抗的变化，然后使用系统内置软件，根据校准曲线就可得出样品中微生物的数量。