对本病诊断的最好线索是患者的症状、关节体征和关节外表现及家族史。AS最常见的和特征性早期主诉为下腰背发僵和疼痛。由于腰背痛是普通人群中极为常见的一种症状，但大多数为机械性非炎性背痛，而本病则为炎性疼痛。以下5项有助于脊柱炎引起的炎性背痛和其他原因引起的非炎性背痛的鉴别
一、体格检查
骶髂关节和椎旁肌肉压痛为本病早期的阳性体征。随病情进展可见腰椎前凸变平，脊柱各个方向活动受限，胸廓扩展范围缩小，及颈椎后突。
以下几种方法可用于检查骶髂关节压痛或脊柱病变进展情况：
1、枕壁试验
正常人在立正姿势双足跟紧贴墙根时，后枕部应贴近墙壁而无间隙。而颈僵直和（或）胸椎段畸形后凸者该间隙增大至几厘米以上，致使枕部不能贴壁。
2、胸廓扩展
在第4肋间隙水平测量深吸气和深呼气时胸廓扩展范围，两者之差的正常值不小于2.5cm，而有肋骨和脊椎广泛受累者则使胸廓扩张减少。
3、Schober试验
于双髂后上棘连线中点上方垂直距离10cm及下方5cm处分别作出标记，然后嘱患者弯腰（保持双膝直立位）测量脊柱最大前屈度，正常移动增加距离在5cm以上，脊柱受累者则增加距离少于4cm。
4、骨盆按压
患者侧卧，从另一侧按压骨盆可引起骶髂关节疼痛。
5、Patrick试验（下肢4字试验）
患者仰卧，一侧膝屈曲并将足跟放置到对侧伸直的膝上。检查者用一只手下压屈曲的膝（此时髋关节在屈曲、外展和外旋位），并用另一只手压对侧骨盆，可引出对侧骶髂关节疼痛则视为阳性。有膝或髋关节病变者也不能完成4字试验。
二、影像学检查
X线表现具有诊断意义。AS最早的变化发生在骶髂关节。该处的X线片显示软骨下骨缘模糊，骨质糜烂，关节间隙模糊，骨密度增高及关节融合。通常按X线片骶髂关节炎的病变程度分为5级：0级为正常，Ⅰ级可疑，Ⅱ级有轻度骶髂关节炎，Ⅲ级有中度骶髂关节炎，Ⅳ级为关节融合强直。对于临床可疑病例，而X线片尚未显示明确的或Ⅱ级以上的双侧骶髂关节炎改变者，应该采用计算机断层（CT）检查。该技术的优点还在于假阳性少。但是，由于骶髂关节解剖学的上部为韧带，因其附着引起影像学上的关节间隙不规则和增宽，给判断带来困难。另外，类似于关节间隙狭窄和糜烂的骶髂关节髂骨部分的软骨下老化是一自然现象，不应该视为异常。磁共振成像技术（MRI）对了解软骨病变优于CT，但在判断骶髂关节炎时易出现假阳性结果，又因价格昂贵，目前不宜做为常规检查项目。
脊柱的X线片表现有椎体骨质疏松和方形变，椎小关节模糊，椎旁韧带钙化以及骨桥形成。晚期广泛而严重的骨化性骨桥表现称为“竹节样脊柱”。耻骨联合、坐骨结节和肌腱附着点（如跟骨）的骨质糜烂，伴邻近骨质的反应性硬化及绒毛状改变，可出现新骨形成。
三、实验室检查
活动期患者可见血沉增快，C~反应蛋白增高及轻度贫血。类风湿因子阴性和免疫球蛋白轻度升高。虽然AS患者HLA-B27阳性率达90％左右，但无诊断特异性，因为正常人也有HLA-B27阳性。HLA-B27阴性患者只要临床表现和影像学检查符合诊断标准，也不能排除AS可能。
四、诊断标准
近年来有不同标准，但现仍沿用1966年纽约标准，或1984年修订的纽约标准。但是，对一些暂时不符合上述标准者，可参考欧洲脊柱关节病初步诊断标准，符合者也可列入此类进行诊断和治疗，并随访观察。
1、纽约标准（1966年）：有X片证实的双侧或单侧骶髂关节炎（按前述0~Ⅳ级分级），并分别附加以下临床表现的1条或2条，
AS要求有： X线片证实的Ⅲ~Ⅳ级双侧骶髂关节炎，并附加上述临床表现中的至少1条；或者X线证实的Ⅲ~Ⅳ级单侧骶髂关节炎或Ⅱ级双侧骶髂关节炎，并分别附加上述临床表现的1条或2条。
2、修订的纽约标准（1984年），下腰背痛的病程至少持续3个月，疼痛随活动改善，但休息不减轻；腰椎在前后和侧屈方向活动受限；胸廓扩展范围小于同年龄和性别的正常值；双侧骶髂关节炎Ⅱ~Ⅳ级，或单侧骶髂关节炎Ⅲ~Ⅳ级。
3、欧洲脊柱关节病研究组标准：炎性脊柱痛或非对称性以下肢关节为主的滑膜炎，并附加以下项目中的任何一项。