内切酶和外切酶的区别是水解位置不同。核酸内切酶是一类能从DNA分子中间水解磷酸二酯键，从而切断双链DNA的核酸水解酶。核酸外切酶是一类能从多核苷酸链抄的一端开始按序催化水解3、5-磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。切点要求不同核酸内切酶的切点大多很严格，要求专一的核苷酸顺序，即识别顺序。而核酸外切酶的切点要求比较低。
限制性核酸内切酶从各种细菌和古生菌中获得，每一种都对多核苷酸链中的不同位点具有特异性。
切割的序列形成单链末端，也称为粘性末端，然后通过DNA连接酶进行杂交。产生的DNA称为重组DNA，该过程称为重组。
限制性核酸内切酶是最重要的核酸内切酶组之一，根据其作用机制分为三类。
I型核酸内切酶是在大约1000个碱基对的随机位点切割的大型多亚基复合物。II型核酸内切酶是在没有ATP的情况下切割序列的较小亚基。III型核酸内切酶也很复杂，可切割25个碱基对的序列。
核酸内切酶可以切割双链DNA、单链DNA甚至RNA。
这些酶对于DNA修复至关重要，因为它们可以精确地识别和切割受损的DNA。
这可以防止不必要的切割和其他酶可能发生的进一步损害。
限制性核酸内切酶在其作用之前可能会经历一段滞后期。这种滞后期可能是由于识别特定站点所需的时间。
因为核酸内切酶会在中间切割DNA片段，所以会产生寡核苷酸。
一些核酸内切酶具有防御功能，可以防止某些病原体进入。
单链的核酸外切酶包括大肠杆菌核酸外切酶Ⅰ（exoⅠ）和核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）。核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）能够从5′-末端或3′-末端呈单链状态的DNA分子上降解DNA，产生出寡核苷酸短片段，而且是唯一不需要Mg2+离子的活性酶，是一种耐受性很强的核酸酶。核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）可以用来测定基因组DNA中一些特殊的间隔序列和编码序列的位置。它只切割末端有单链突出的DNA分子，实际操作时需要配合解旋酶操作。