作为骨架的环状质粒经过限制性内切酶的作用被切开成线性的质粒。如果目的基因能够成功插入位点,那么经过链接酶的作用,线性的骨架质粒和你的目的基因又能够成功变成一个环状质粒。环状质粒上的基因能够得到表达,所以能产生对某种抗生素的抗性,而线性的质粒不能。我们可以通过这个了解是否有环状的质粒存在(希望是带有目的基因的,而不是原先骨架质粒)怎么确保原先的骨架质粒没有重新连接起来呢?一是我们可以用2种不同的限制性内切酶,使得切口之间不能互相连接。二是我们可以用牛小肠磷酸酶去处理酶切后的骨架质粒,让它们自我连接的能力降到最低。在带有抗性的培养基上长出菌落后,还应对这些菌落进行PCR的检测,以观察是否有目的基因的导入。
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