提取质粒的主要步骤

如题所述

质粒抽提方法即去除 RNA,将质粒与细菌基因组 DNA分开,去除蛋白质及其它杂质,以得到相对纯净的质粒。

提取质粒DNA的方法有很多种,从提取产量上分可分为微量提取、中量提取、大量提取,从使用仪器上分可分为一般提取和试剂盒方法提取,从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等,各种不同的方法各有其优缺点,根据不同的实验目的可以采用合适的提取方法。详细内容请参考《分子克隆实验指南》。 另外,复旦大学生化与分子生物学实验室一篇文章,提供了质粒提取机理的详细解说。

碱裂解法

人们使用碱与SDS裂解法从E. coli(大肠杆菌)中分离制备质粒DNA已有30多年的历史。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中,会使细胞壁破裂,染色体DNA和蛋白质变性,将质粒DNA释放到上清中。

尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏,闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离,这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。只要OH-处理的强度和时间不要太过,当pH值恢复到中性时,DNA双链就会再次形成。在裂解过程中,细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物,后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用K+取代Na+时,复合物会从溶液中有效地沉淀下来,离心除去变性剂后,就可以从上清中回收复性的质粒DNA。

在SDS存在的条件下,碱水解是一项非常灵活的技术,它对E. coli的所有菌株都适用,并且其细菌培养物的体积可以从1-500mL以上。

煮沸法

煮沸法是将细菌悬浮于含有Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中,然后加热到100℃使其裂解。加热除了破坏细菌外壁,还有助于解开DNA链的碱基配对,并使蛋白质和染色体DNA变性。但是。闭环质粒DNA链彼此不会分离,这是因为它们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构。当温度下降后,闭环DNA的碱基又各就各位,形成超螺旋分子,离心除去变性的染色体DNA和蛋白质,就可从上清中回收质粒DNA。煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒很有效,可用于提取少至lmL(小量制备),多至250mL(大量制备)菌液的质粒,并且对大多数的大肠杆菌菌株都适用。但对于那些经变性剂、溶菌酶及加热处理后能释放大量碳水化合物的大肠杆菌菌株,则不推荐使用该法。这是因为碳水化合物很难除去,会抑制限制酶和聚合酶活性。若碳水化合物的量很大,在CsCl-溴化乙锭梯度离心中会使超螺旋质粒DNA带变得模糊不清。大肠杆菌菌株HBl01及其衍生菌株(其中包括TGl)能产生大量的碳水化合物,不适于用煮沸法裂解。

质粒小提试剂盒

用于大肠杆菌中质粒DNA的小量提取,它结合了优化的碱裂解法,以及方便快捷的硅膜离心技术,具有高效,快捷的特点,能在30min内完成全部操作。利用试剂盒能从1-5mL过夜培养的大肠杆菌菌液中纯化得到10-40μg高质量的质粒DNA(OD260/OD280=1.7-1.9),此质粒DNA可直接用于DNA序列分析,各种酶促反应,PCR以及部分细胞系的转染等。
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第1个回答  2020-10-08
1. 准备20ml灭菌过的培养管,编号,分别加入8ml LB培养基,再加入8µl 相应抗生素,可适量多加;
2. 用10µl 白色枪头挑取挑取单个菌落至培养管中,37℃震荡过夜(274rpm);
3. 取2ml过夜培养的菌液加入离心管中,室温10000rpm离心2min,去上清;(可重复步骤2,直至菌液离心完)(去上清时用纸吸一下)
4. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250µl Buffer P1(含RNase A),使用移液枪充分混匀,悬浮菌体菌体;
5. 向离心管中加入250µl Buffer P2,温和地上下颠倒混匀4~6次,获得澄清的裂解液;(剧烈混合会使剪切染色体DNA,降低质粒纯度)
6. 向离心管中加入350µl Buffer N3, 立即温和地上下颠倒混匀4~6次,此时出现白色絮状沉淀。室温10000rpm离心15min;
7. 小心将步骤6中所得的上清液转移至洁净的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000rpm离心1min,至裂解物完全通过吸收柱,倒掉收集管中的废液;
8. 向吸附柱中加150µl Buffer PB,10000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液;
9. 向吸附柱中加400µl Buffer PW(检查是否加入无水乙醇),10000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液。再空离一次,2min(此时可以加热 Buffer EB,65~70℃);
10. 将吸附柱置于一个新的离心管中,打开盖子,吹风4min左右(确保乙醇被去除,乙醇会影响下面的步骤);
11. 向吸附柱的吸附膜中间部位加90µl Buffer EB(pET系列拷贝数低,加EB 70μl即可),室温静置2min。10000rpm离心1min;
12. 把液体倒回吸附柱,在10000rpm离心1min;
13. 混合质粒至一个离心管中,做好标记,开盖室温放置两小时左右。-40℃保存质粒。
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