测细胞凋亡，贴壁细胞dapi染色，还需要固定吗

Question

如题所述

Answer 1

测细胞凋亡，贴壁细胞dapi染色，最好是固定。

DAPI溶液是半通透性的，不固定的话，细胞染色时间得长，染料进入细胞会比较少，所以建议是固定。

DAPI 可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。

DAPI溶液使用步骤：

固定细胞或组织样品，经过固定后，适当洗涤除去固定剂。如果需要进行免疫荧光染色，可先进行免疫荧光染色，染完毕后再进行 DAPI 染色。如果不需要进行其它染色，则直接进行 DAPI 染色。

对于贴壁细胞或组织切片，加入少量 DAPI 染色液，覆盖住样品即可；对于悬浮细胞，至少加入待染色样品体积 3 倍的染色液，混匀。

室温染色 5-10 分钟。

吸除 DAPI 染色液，用 TBST、PBS 或生理盐水洗涤 2-3 次，每次 3-5 分钟。

置于荧光显微镜下观察，激发波长 360-400nm。

DAPI溶液注意事项：

DAPI 被普遍认为具有致癌性，操作时应戴手套，并避免交叉污染。

DAPI溶液需避光，并尽量避免反复冻融。

荧光染料都存在淬灭问题，建议染色后尽量当天完成检测。

Answer 2

细胞凋亡的形态学检测
根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。

1. 光学显微镜和倒置显微镜
(1) 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。

(2) 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。

2. 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜
一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。

常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与 DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。

结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1）。

3 透射电子显微镜观察
结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

二、磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)
磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

方法
1. 悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞(0.5~1×106)用PBS洗2次，加入100 ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V(20ug/ml)10 ul，室温避光30 min，再加入PI(50 ug/ml)5 ul，避光反应5 min后，加入400 ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测(一般不超过1 h)， 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。
2. 贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。
3. 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。
结果 [图4、图5]

注意事项
1. 整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。

2. 操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。本回答被提问者采纳