第1个回答 2022-12-31
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如何人工方法提高聚合酶的保真度
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恒之雁005
2022-12-23 超过51用户采纳过TA的回答
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DNA聚合酶是PCR反应中不可或缺的组成部分,是参与DNA复制中的重要酶,被用在生物及医学等领域的各个研究方向上。PCR技术发明至今40多年的时间里,从早期被发现的Taq DNA聚合酶到现在,酶越来越多样化。随着新酶的发现和对旧酶的改造,DNA聚合酶的保真性、特异性、灵敏度等都获得了明显的改进
高保真DNA聚合酶有聚合中心和酶切中心,聚合中心具有5'→3'的DNA聚合酶活性,可沿 5'→3'方向催化合成 DNA;酶切中心具有3'→5'外切酶活性,可以进行碱基错配的修复。常见的高保真DNA聚合酶类型有Pfu、KOD等。
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图2. DNA聚合酶的作用原理[2]
如何选择高保真酶
对于测序、基因功能研究、蛋白表达、定点突变等,高保真性的扩增是非常重要的,可以确保各种扩增子的可靠扩增。以测序文库扩增过程为例,测序过程中的突变会给序列拼接造成困难,甚至会干扰某些需要低频检测的分析结果。对于市场上琳琅满目的各种高保真DNA聚合酶,选择一款合适的酶产品是极为必要的。市面上常见的高保真酶特性主要包含保真度、扩增速率、特异性、是否耐U等。
保真度:错配率是计算高保真DNA聚合酶保真性的一个通用标准,错配率越低代表其保真性越好,保真度常用错配率的倒数表示(保真度=1/错配率),不同的测定方法也会产生不同的结果。常见的测定方法有以下三种:
检测方法
检测原理
优缺点
蓝白斑筛选测定
利用DNA聚合酶扩增lacZ基因,它可以还原β-半乳糖苷酶基因活性并产生蓝色菌落,结合蓝白斑筛选的结果可以评估保真度。
快速、相对简单、经济有效;但是精确度不高,无法区分DNA的同义突变。
一代测序
将PCR扩增产物克隆至相应的载体中,通过对转化后的单菌落进行Sanger测序,对测序结果中错配的核苷酸数进行分析其保真度。
精确度高,可以检测到所有的突变,但是工作量和成本都比较高。
第2个回答 2023-01-01
如何人工方法提高聚合酶的保真度
回答:通过在pcR高保真确反应体系中加入Triton X-100,羟丙甲基纤维素和氯化镁缓冲液等方法来提高高保真DNA聚合酶的扩增效率。
第3个回答 2023-01-01
保真度:错配率是计算高保真DNA聚合酶保真性的一个通用标准,错配率越低代表其保真性越好,保真度常用错配率的倒数表示(保真度=1/错配率),不同的测定方法也会产生不同的结果。常见的测定方法有以下三种:
检测方法
检测原理
第4个回答 2022-12-22
亲你好。. Q:高保真DNA聚合酶扩增产物为平末端,TA克隆(或二代测序文库构建)如何在产物末端加A? A:Taq DNA聚合酶(Yeasen Cat#13486)具有的脱氧
2. Q:不同的高保真DNA聚合酶产品保真度有可比性。