荧光素酶报告基因的结果在什么范围算是阳性

Question

如题所述

Answer 1

荧光素酶报告基因的结果在什么范围算是阳性
转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase
assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。
其原理简述如下：
（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。
（2）
将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。
（3）
加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

Answer 2

只能先就标题的问题谈谈我的认识。后面的追问我了解得也不全面。
1。两者的结果检测方法不同。gfp绿色荧光蛋白，很直观，能够直接检到荧光，在普通的细胞培养条件下都能够观察到，对细胞的生命活动和其他并行的实验安排影响很小。荧光素酶报告基因使用起来比gfp多一个步骤，因为荧光素酶是个酶，不发荧光，发荧光的是它的底物，荧光素。荧光素在细胞里（要说萤火虫细胞我就不知道了哦）是没有的。
所以检测荧光素酶的通常步骤是裂解细胞，释放荧光素酶，与荧光素及其他所需化学物质混合，才得到荧光。现在虽然也有活细胞内检测荧光素酶的手段，但要将荧光素送入活细胞，本身就已要对细胞进行相当的干扰。所以一般来说荧光素酶实验的同一批细胞不适合再做其他并行实验。
2。两者的结果含义不同。gfp如果说是定量检测表达蛋白的话，这个定量只能够指，表达的细胞是多少个，不表达的细胞是多少个。gfp对于单个细胞来说，就有阳性和阴性两种结果罢了。gfp不能够定量地告诉你，这个/群细胞里的表达量是多高还是多低。荧光素酶就能够定量地得到表达量/表达水平的数值，但这个数值是相对于一群细胞来说，而不是对于单个细胞。所以荧光素酶常常用来研究启动子的功能与调控，因为启动子对基因表达的调控可以是渐变的，而不是简单的开和关两种状态。