在构建基因表达载体时要用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶。
基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施
基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其构建目的是使目的基因能在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
过程：
首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同
一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的
脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组
DNA分子。如人的
胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组DNA分子（也叫重组质粒）的。