1 RT-PCR技术
RT-PCR是英文Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction的简写，中文称之为反转录聚合酶链式扩增反应。在反转录酶M-MLV或AMV的作用下，以RNA为模板、以20个左右的核苷酸为引物，反转录合成cDNA。再以cDNA为模板，两个3和5端互补寡核苷酸引物，由Taq聚合酶从5→3进行一系列DNA聚合反应，扩增出所需要的目的DNA，可将极微量的靶DNA特异性地扩增上百万倍，从而大大提高了对DNA分子的分析和检测能力。
利用PCR技术，可以检测到单分子核酸或对每10万个细胞中仅含1个靶核酸分子的样品。因此，该技术创立至今十年来，迅速地形成为常规的标准程序，为生物科学提供了从微量微生物材料中快速得到大量特定的遗传物质的实验手段。PCR在植物病毒的检测、鉴定和植物病毒的检疫工作中也将具有重要意义。如果病毒核酸是DNA类型，不需要反转录（RT），直接可以进行聚合酶链式扩增（PCR）。而大多数植物病毒的核酸类型为RNA，因此，需要先进行反转录（RT），再进聚合酶链式（PCR）扩增。用1%琼脂糖和5%聚丙烯酰胺进行电泳，即可检出扩增片段。
这里以香石竹斑驳病毒为例，介绍RT-PCR检测香石竹斑驳病毒的实验技术。
用已知病毒核酸保守序列设计引物，分别提取病、健植物总RNA为模板，进行RT-PCR反应，琼脂糖或PAGE电泳检测扩增结果。感病材料会出现特异扩增带。如香石竹斑驳病毒（Carnation mottle virus，CarMV）。根据该病毒的RNA序列设计引物，P1引物（5′端引物，与CarMV RNA的2516～2538同源）：5′-〔TTA，GTT，TGC，CCC，CGT，TGG，TAA，CC〕-3′。P2引物（3′端互补引物，与CarMV RNA的3100～3124对应）：5′-〔AAG，CGT，CAT，CGT，TGA，ATC，CCA，GAG〕-3′。目标片段大小为608nt。对病健材料进行了RT-PCR，从感病材料中可以扩增出了大约600bp的特异片段，而健康植物无此扩增带。用此方法可以快速、准确地检测香石竹斑驳病毒。操作如下：
（1）RNA提取
分别取感病及健康叶片0.2～0.5g，加液氮研成粉末，按1g∶2ml的比例悬浮于RNA抽提缓冲液（20mmol/L Tris-HC1 pH8.0，1mmol/L EDTA，1%SDS，0.2%巯基乙醇）。按1∶1比例加入水饱和苯酸—氯仿—异戊醇（25∶24∶1）混合液，抽提数次，乙醇沉淀总RNA。溶入20～50μl TE缓冲液中，-70℃冰箱保存备用。
（2）cDNA合成反应体系组分为
待检测材料总RNA或健康材料总RNA各0.5/μg，20pmol/L引物P21μl，5×MMLV缓冲液4μl，ddH2O7μl，该混合液于88℃处理10min后冰上迅速冷却，然后加入10mmol/L dNTPs 1μl，40U/μl Rnasin 0.5μl，100mmol/L DTT 2μl，200U/μl MMLV逆转录酶1μl，混合后经42℃处理lh，合成cDNA。
（3）PCR扩增
取上述的cDNA各0.5μg，分别加入10×PCR缓冲液5μl，20pmol/L引物P1和引物P2各1μl，10mmol/LdNTPs 1μl，88℃10min之内加2U/μl Taq DNA聚合酶1μl，加ddH2O至50/μl。然后在液面上加三滴石蜡油，进行如下PCR热循环：94℃3min，60℃1min，72℃1min，1次循环；94℃40s、60℃1min，72℃1min，35次循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检查。携带CarMV的样品会出现600bp的特性扩增带。如图1。
图1 CarMV PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果
1.提纯病毒材料PCR扩增 2.感病组织PCR产物 3.健康组织PCR产物 4.分子量标准
RT-PCR技术是检测植物病毒中灵敏度最高的方法之一。其灵敏度比ELISA高100～1000倍。比核酸分子杂交高10～100倍。目前已有PVY、CMV、CarMV、TAV、CVB、ToRSV、TRSV、PNRSV等花卉病毒的特异引物和成熟的RT-PCR技术。
2 核酸分子杂交
核酸分子杂交是基于植物病毒的RNA或DNA链之间的碱基配对的基本原理。当双链DNA分子加热时，链间的氢键被破坏，两条链分开，变性分开的单链冷却时，碱基的氢键重新形成，双链复原。在变性分开的RNA或DNA单链上加上同位素或非同位素标记，做成探针，和待检测样品的RNA或DNA进行碱基特异性配对而形成稳定双链分子，通过检测同位素的放射性和非同位素的显色或荧光来检测样品的RNA或DNA是否与探针发生杂交反应。根据已知病毒核酸序列设计引物，用标准阳性材料，即已分离、鉴定的某种病毒材料，提取总RNA，用反转录酶反转录形成cDNA，用同位素或非同位素标记此cDNA，制备成探针，与待测样品进行分子杂交。如果能杂交，出现阳性，说明待测样品含有已鉴定的该病毒。该方法能快速、高效地检测植物携带病毒的情况。
用于检测的杂交有斑点杂交和核酸吸印转移杂交。斑点杂交是将待测样品的DNA或RNA和汁液点于硝酸纤维素膜上，经干燥后，与同位素或非同位素标记的探针发生杂交反应，以检测样品中是否存在待测病毒。斑点杂交是一种快速、简便、经济的快速检测和鉴定病毒的方法。核酸吸印转移杂交需要先将待测样品的DNA或RNA经限制性内切酶切为大小不等的片段，电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上，经干燥后，再与同位素或非同位素标记的探针发生杂交反应，以检测样品中是否存在待测病毒。
核酸分子杂交灵敏度不如RT-PCR高，但此技术不受病毒不同株系的影响，无株系专化性。
不同实验方法测定植物病毒具有不同灵敏度（表1），可以根据需要选用。
表1 不同实验方法测定植物病毒的灵敏度比较
