聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理&步骤

Question

如题所述

Answer 1

SDS-PAGE，即十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，是用于测定蛋白质分子量、分离、分析、纯化、定性、定量和少量制备蛋白质的技术。其原理涉及蛋白质样品的前处理、SDS的使用、溴酚蓝的作用以及聚丙烯酰胺凝胶的结构。

在蛋白质样品制备中，还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）用于破坏二硫键，消除二级结构差异影响。十二烷基硫酸钠（SDS）处理使所有蛋白质带上均等负电荷，当施加电压时，蛋白质分子按分子量大小迁移，而不是电荷量或构象。聚丙烯酰胺凝胶提供三维网络结构，使蛋白质分子通过，其孔径大小与比例决定于丙烯酰胺和双丙烯酰胺。

凝胶聚合通过过硫酸铵提供硫酸盐基团，催化生成自由基，与TEMED作为催化剂的硫酸盐自由基协同作用。浓缩胶具有小孔径，用于压缩蛋白质样品以加速分离胶的电泳过程。分离胶具有分子筛效应，孔径随pH增加而减小，使蛋白质按照分子量大小自由分离。

SDS-PAGE工作流程包括使用特定的电泳缓冲液。例如，5x甘氨酸电泳缓冲液由Tris碱、甘氨酸、SDS和双蒸水配制，pH值为8.3。通过这一流程，蛋白质样品被有效分离，便于后续的分析与研究。