判定奶牛发情的方法有外部观察法、直肠检查法、阴道检查法和试情法。正常发情的奶牛通过外部观察法即可确认发情，而有经验的配种人员通过直肠检查确定卵泡发育程度并确认适宜的配种时间，试情法则多用于群牧繁殖母牛群。
（1）外部观察法
为生产中最常用的方法。发情母牛主要表现是：初期，兴奋不安，哞叫、追逐、闻嗅和试图爬跨其他母牛，阴门湿润并有轻度肿胀。中期，频繁爬跨其他母牛，同时也接受其他牛的爬跨；不停哞叫和频繁走动，对声音特别敏感，两耳直立；食欲减退，产奶量下降；阴门红肿，流出透明的黏液；个别奶牛还伴有体温升高现象。后期，多数母牛不再让其他牛爬跨，嗅其他母牛；食欲逐渐转入正常，产奶量回升；阴门尚有清亮黏液流出。饲养经验证明，多数母牛在每天早晨和傍晚天气凉爽时发情表现比较明显，因此，对奶牛发情的观察一般在每天早晨挤奶前，下午挤奶前和晚上10点左右进行，效果比较理想。
（2）阴道检查法
有经验的配种员、兽医师利用专用的开膣器，严格按规范操作，打开母牛阴道，进行检查。发情母牛阴道黏膜充血潮红，有流动性透明黏液，子宫颈肿胀，子宫颈外口松弛并开张，同时可见较多的黏液附在子宫颈口及其边缘。不发情的母牛阴道黏膜苍白，较干燥，子宫颈紧闭。妊娠母牛阴道黏膜干燥呈桃红色，子宫颈外口呈苍白色并收缩突出，并有黏膜覆盖或黏液团堵塞。将子宫颈的黏液取出，涂片于显微镜下观察，处于充分发情时，抹片呈羊齿植物状结晶花纹；到发情末期，则结晶结构较短，呈现金鱼藻或星芒状。
（3）直肠检查法
此法通过直肠，用手指检查子宫的形状、粗细、大小、反应以及卵巢上卵泡的发育情况来判断母牛的发情。发情母牛子宫颈稍大、较软，子宫角体积略增大，子宫收缩反应比较明显，子宫角坚实。卵巢中的卵泡突出，圆而光滑，触摸时略有波动。卵泡直径发育初期为1.2～1.5厘米，发育最大时为2.0～2.5厘米。在排卵前6～12小时，随着卵泡液的增加，卵泡紧张度与卵巢体积均有所增大。到卵泡破裂前，其质地柔软，波动明显，排卵后原卵泡处有不光滑的小凹陷，以后就形成黄体，该方法特别适用于外部发情症状不明显（安静发情、不完全发情）奶牛的发情鉴定。直肠检查法是最准确的发情鉴定法，但操作人员需要有一定的经验。
（4）试情法
利用试情公牛进行试情，可观察到试情公牛紧随发情母牛，或者在试情公牛胸前涂以颜色或安装带有颜料的标记装置，放在母牛群中，凡经爬跨过的发情母牛，都可在尻部留下标记，效果较好。
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