稳定细胞株的构建流程?

Question

如题所述

Answer 1

构建稳定细胞株是一种常用的实验技术，用于长期表达特定蛋白质或进行功能研究。下面是一般的稳定细胞株构建流程：

稳转细胞株构建

选择宿主细胞系：选择能够稳定承载外源基因的细胞系作为宿主细胞。常用的细胞系包括HEK293、CHO、HeLa等。

构建表达载体：设计和构建包含目标基因的表达载体。在载体中通常包括启动子、选择标记基因（例如抗生素抗性基因）以及目标基因的编码序列。

转染：将表达载体转染到宿主细胞中。可以使用多种转染方法，如化学法、电穿孔法、病毒载体介导转染等。选择筛选：在转染后添加相应的选择压（例如抗生素），以筛选出已成功集成表达载体的细胞。通常会对细胞进行适当的稀释，以确保每个克隆细胞单元可以正常生长。

单克隆筛选：从筛选后的细胞中挑选出单个细胞克隆。可以使用稀释法或限稀稀释法在96孔板或384孔板中进行单克隆落座。

鉴定：对单克隆细胞进行筛选和鉴定，确认是否成功集成目标基因。常用的鉴定方法包括PCR、Western blot、荧光显微镜观察等。

扩增和冻存：从鉴定合格的单克隆细胞中选择合适的克隆，进行细胞扩增，保存备份细胞，并进行冻存以便后续实验使用。

长期维持：定期传代和培养稳定细胞株以维持其稳定表达目标基因的特性。同时，必要时进行对稳定细胞株的验证和鉴定。

在每个步骤中都要注意操作条件、培养基、培养条件和实验室安全等因素，以确保稳定细胞株的成功构建。具体的流程和条件可能因实验目的、细胞系和载体设计等因素而有所不同。因此，在实施之前，最好参考相关文献和经验，并根据实际情况进行优化和调整。