第1个回答 2018-06-26
参照以下real-time PCR引物设计原则:
1.最好位于编码区5’端的300-400bp区域内,可以用DNAman,Alignment 软件看看结果.
2.产物不能形成二级结构(自由能小于58.61KJ/mol).
3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大.
4.G+C含量在40%~60%之间,45-55%最佳.
5.碱基要随机分布,尽量均匀.
6.引物自身不能有连续4个碱基的互补.
7.引物之间不能有连续4个碱基的互补.
8.引物5′端可以修饰.
9.3’端不要以A结尾,3′端不可修饰,而且要避开AT,GC rich的区域,避开T/C,A/G连续结构(2-3个).
10.引物3′端要避开密码子的第3位.
11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端,且3‘端自由能最好小于9KJ/mol.可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况.
12.做荧光定量产物长度80-150bp最好,最长是300bp.
13.引物设计避免DNA污染,最好跨外显子接头区.
14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70%或者有8个互补碱基同源.
15.查看有无假基因的存在.假基因就是无功能的DNA序列,与需要扩增的目的片段长度相似.
16.TM值在55-63度之间.
17..引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70%或者有8个互补碱基同源.本回答被网友采纳
第2个回答 2019-04-28
1、染料法引物的设计原则:
(1)、序列选取应在基因的保守区段,不能有碱基变异;
(2)、避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对,避免引物
自身形成环状发卡结构;
(3)、检测mRNA时,为避免基因组的扩增,引物设计最好能跨两个外显
子;
(4)、引物之间的TM相差避免超过2℃;
(5)、典型的引物18到24个核苷长;
(6)、目的基因和内参基因所扩增的PCR产物长度尽量一致,不大于
300bp,这样有利于使两种基因PCR效率相同
(7)、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做BLAST分析其
特异性
2、Taqman探针及引物的设计原则:
(1)、序列选取应在基因的保守区段,不能有碱基变异;
(2)、检测mRNA时,为避免基因组的扩增,引物设计最好能跨两个外显
子;
(3)、引物TM值为60℃左右,探针的TM值为70℃左右;
(4)、探针的5’端应避免使用鸟嘌呤G,因为5’G会有淬灭作用,而且即使
是被切割下来还会存在淬灭作用;
(5)、整条探针中,碱基C的含量要明显高于G的含量 G含量高会降低反应
效率,这时就应选择配对的另一条链作为探针;
(6)、引物之间的TM相差避免超过2℃;
(7)、典型的引物长度为18-24bp,探针长度为15-45bp;
(8)、PCR产物长度在50-150bp之间,这样有利于使PCR效率相同;
(9)、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做BLAST分析其
特异性