为什么trizol提不出来rna

如题所述

trizol提不出来rna的原因有可能是以下原因:

1)你的Trizol试剂核有无问题?
2)研究材料是否新鲜,RNA容易降解,应妇80度保存。
3)如果都没问题,你的操作有无问题?


trizol提取rna的步骤:(仅供参考)

用户需自备的试剂和材料 

无水乙醇、氯仿、Glycogen(可能需要)、 1.5ml Eppendorf管(RNase-free)、 Tips(RNase-free) 

 

准备工作 

RNase酶非常稳定,是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活,但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上,因此,在与RNA制备有关的分子生物学实验时,必须戴手套。 

RNase的又一污染源是取液器,根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部,基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。 


料制品的处理 

尽可能使用无菌,一次性塑料制品,已标明RNase-Free 的塑料制品,如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品,原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下: 

    在玻璃烧杯中注入去离子水,加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意:DEPC为剧毒物,活性很强,小心在通风柜中使用。

    处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入DEPC水溶液,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。 

    在通风柜中室温处理过夜。

    将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯,高温高压蒸气灭菌至少30分钟。

    烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。 


 璃玻和金属物品 250°C烘烤3小时以上。 


从组织中提取总RNA

    液氮研磨:组织块直接放入研钵中,加入少量液氮,迅速研磨,待组织变软,再加少量液氮,再研磨,如此三次,按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol,转入离心管进行第2步操作。

    匀浆:组织样品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol。另外,组织体积不能超过Trizol体积的10%,否则匀浆效果会不好,用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。 


 从细胞中提取总RNA

    培养贴壁细胞:不须消化,可直接用Trizol进行消化、裂解,Trizol体积按250px2/ml比例加入。

    悬浮细胞可直接收集、裂解,每1ml Trizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞,或107细菌细胞。 

 

操作步骤 

    细胞或组织加Trizol后,室温放置5min,使其充分裂解。注:此时可放入-70℃长期保持。

    12,000rpm 离心5min,弃沉淀。 

    按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿,振荡混匀后室温放置15min。注:禁用漩涡振荡器,以免基因组DNA断裂。

    4℃ 12,000g离心15min。

    吸取上层水相,至另一离心管中。注:千万不要吸取中间界面;若同时提取DNA和蛋白质,则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA,则弃下层酚相。

    按0.5ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀,室温放置5-10min。

    4℃ 12,000g离心10min,弃上清,RNA沉于管底。

    按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇,温和振荡离心管,悬浮沉淀。

     4℃ 8,000g离心5min,尽量弃上清。

    室温晾干或真空干燥5-10min。 注:RNA样品不要过于干燥,否则很难溶解。

    可用50ul H2O,TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品,55-60℃,5-10min。注:H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。

    测O.D值定量RNA浓度。注:此方法提取RNA A260/A280值在1.6-1.8之间;产率估计:组织标本:(ug RNA/mg组织)1-10ug,培养细胞(ug RNA/106 Cell):5-15ug。

注:组织或细胞量过少,可酌情减少Trizol用量;组织或细胞用量过多,会引起DNA对RNA的污染;

高蛋白、脂肪或多糖类组织,肌肉组织或块状植物组织等,组织匀浆或液氮研磨后须4℃ 12,000g离心10min去掉不溶物,再进行下面操作,若顶层有脂肪物,则也须去掉;

热天提RNA,带手套是必须的,手是RNase的主要来源;

组织块用液氮研磨,效果最好,若没有液氮或电动匀浆器,可用手动匀浆器代替,此时组织块不宜过大,且需先用眼科剪刀将组织碱碱剪碎,然后再充分研磨。 

温馨提示:答案为网友推荐,仅供参考
相似回答