细菌的分子生物学鉴定要怎么做?

1、是要做PCR和16S吗?做这两个的步骤是怎么样的?
2、引物要怎么选择?
3、G+菌和G-菌选择的引物是不一样的么?

毕业课题要鉴定细菌,但是本科生对于PCR都只是随便提到,很迷茫

是的,要做PCR。
首先你要提出细菌的DNA。
方法如下:
1、液体培养及保种:从斜面上挑取菌苔于液体培养基中放摇床上震荡(转速160r/min)培养16小时。吸取菌液于1.5ml的经过灭菌的EP管中,再加甘油(30-40%)进行保种。(-80摄氏度保藏2年)
2、提取DNA(CTAB法):
(1)取1.5ml菌液于1. 5ml离心管中,12000r/min离心2min,弃上清。
(2)向沉淀物中加入350ul双蒸水,重新悬浮沉淀。
(3)加入20ul10%SDS和3ul的蛋白酶K(20mg/ml),溶菌酶3ul,混匀,于50℃温育1h。
(4)加入50ul 5mol/L NaCl溶液,充分混匀,再加入50ul CTAB/NaCl溶液,混合后再65℃温育30min。
(6)冷却后加入等体积的酚(沉淀蛋白质):氯仿:异戊醇(增强酚的作用)(25:24:1),小心上下颠倒混匀,12000r/min离心5min,将上清液转移到新的EP管,重复此步骤2-3次,直至分层界面无白色沉淀。
(7)加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),小心颠倒混匀,12000r/min离心5min将上清液转移到新的EP管。(纯化作用)
(8)加入0.6倍体积的异丙醇,轻轻混合直到DNA沉淀下来,12000r/min离心15min弃上清。
(9)向离心管中加入75%乙醇,12000r/min离心5min洗涤DNA沉淀,小心弃上清,重复洗涤1次,弃上清将离心管倒置于吸水纸上,晾干。
(10)加入50ul(双蒸水)/ TE Buffer溶解DNA于4℃保存。
(11)电泳检测
6、PCR扩增:(细菌的通用引物为27F和1492R)将提取得到的DNA进行PCR扩增,电泳检测扩增得到的16S rDNA(如果菌类分明,条带清晰,PCR原液可直接送去测序,双向测通,得到测序序列后到NCBI的BLAST页面比对,得出鉴定结果)
7、酶切带型分型确定操作单元:将扩增产物用HhaI和HaeIII两种限制性内切酶进行酶切,电泳检测酶切产物,酶切带型相同的分为一个操作单元。
8、连接转化:从每一个操作单元中选取一株菌的16S rDNA进行连接实验。将连接产物转入感受态细胞中,将感受态细胞涂布于含有Amp的平板上,倒置培养12-16h。
9、克隆子挑选及PCR鉴定:从上一步的平板上挑取单菌落于含有Amp的液体培养基中震荡培养12h,以培养液为模板直接进行PCR扩增鉴定(1000-2000bp)。将含有目的片段的克隆子菌液低温保存。
10、测序:将含有目的片段的克隆子菌液送去测序。
11、序列拼接:运用DNAMAN软件对测序得到的序列进行拼接。
12、建树:对拼接得到的序列用Blast进行比对,最后将比对得到的所有序列运用MEGA6建立系统发育树。
温馨提示:答案为网友推荐,仅供参考
相似回答