请教:细菌DNA的提取

如题所述

一、水煮模板法——主要用于PCR反应

操作最简便,对试剂条件要求低。缺点是纯度不够高,可能会含有RNA、蛋白等杂质。但是作为一般检测目的的PCR反应模板已经足够了。

二、CTAB/NaCl 法

CTAB/NaCl法提取的DNA纯度较高,蛋白杂质较少,保存时间长,编者更喜欢把终浓度为20μg/ml RnaseA加在第5步温育的时候,这样最后没有RnaseA污染。每一步操作细致一些,得到的DNA可用于Southern blot。

注意:长时间保存DNA可放于-20℃,但要尽量减少反复冻融,否则影响DNA质量。

三、盐析法

介于方法一和方法二之间,CTAB虽然取出糖分效果较好,但CTAB本身也是有毒的,所以此方法放弃了CTAB。

实验注意:提基因组最好要将枪头尖剪掉(剪掉以后在酒精灯上迅速过一下,使其断口圆滑)。以免枪头损伤基因组,抽干时最好是风干。

扩展资料:

DNA提取方法

一.酚抽提法:先用蛋酶K、SDS破碎细胞,消化蛋白,然后用酚和酚-氯萃取,高速离心后取上清,所得DNA大小为100-150kb

二.甲酰胺解聚法:破碎细胞同上,然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合,再透析获得DNA可得DNA200kb左右。

三.玻璃棒缠绕法:用盐酸胍裂解细胞,将裂解物铺于乙醇上,然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅,DNA沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。

四.异丙醇沉淀法:基本同1法,仅用二倍容积异丙醇替代乙醇,可去除小分子RNA(在异丙醇中可溶状态)

五.表面活性剂快速制备法:用Triton X-100A或NP40表面活性剂破碎细胞,然后用蛋白酶K或酚去除蛋白,乙醇沉淀或透析。

六.加热法快速制备:加热96℃-100℃,五分钟,然后离心后取上清,可用于PCR反应。

七.碱变性快速制备:先用NaOH作用20分钟,再加HCI中和,离心后取上清,含少量DNA。

参考资料来源:百度百科-DNA提取

温馨提示:答案为网友推荐,仅供参考
第1个回答  2017-03-30

细菌DNA提取方案:革兰氏阴性菌,如E.coli,一般有三种可以选择的方法。

一、水煮模板法——主要用于PCR反应

1、接种单菌落于LB或脑心平板,连续画线,37摄氏度培养18-24小时。

2、刮取1~2接种环菌苔加入150微升三蒸水中,混匀,100摄氏度煮沸10分钟。

3、12000转/分钟 离心10分钟,取上清,-20摄氏度保存备用。

操作最简便,对试剂条件要求低。缺点是纯度不够高,可能会含有RNA、蛋白等杂质。但是作为一般检测目的的PCR反应模板已经足够了。

有人称扩增4kb以下片段都可用此种方法制取模版,编者用此类模板PCR可以扩增到3500bp的片段。建议:此法得到的模版保存时间短,强烈建议每月重新制作一次。

二、CTAB/NaCl 法

1、接种一单菌落于5mlLB中,30℃培养过夜,

2、取1ml种子培养液接入100ml2%LB中,37℃、220r/min培养16小时;

3、5000r/min离心10分钟,弃去上清。

4、加入10mlTE离心洗涤后,用10mlTE溶解菌体,混匀,-20℃保存备用。

5、取3.5ml菌悬液,加入184μl10%SDS,混匀,加入37μl10mg/ml蛋白酶K,混匀,37℃温育1小时

6、加入740μl5mol/LNaCl,再加入512μlCTAB/NaCl,混匀,65℃温育10分钟。

7、加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。

8、上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。

9、加入0.6倍的异丙醇,混匀,10000r/min离心5分钟,收集DNA沉淀,用70%乙醇离心洗涤DNA沉淀。

10、用1mlTE溶解DNA,加入终浓度为20μg/mlRNaseA,4℃保存。

CTAB/NaCl法提取的DNA纯度较高,蛋白杂质较少,保存时间长,编者更喜欢把终浓度为20μg/ml RnaseA加在第5步温育的时候,这样最后没有RnaseA污染。每一步操作细致一些,得到的DNA可用于Southern blot。
建议:长时间保存DNA可放于-20℃,但要尽量减少反复冻融,否则影响DNA质量。

三、盐析法

1、1.5ml对数期菌液

2、12000rpm 30 s

3、200ul裂解液(同CTAB/NaCl法),37c,1hr

4、66ul 5M NaCL,混匀充分,12000rpm 10min

5、上清用粗枪头取至新管

6、等体积酚充分混匀,12000rpm 3min,反复抽提至无蛋白层

7、取水层,等体积氯仿混匀,12000rpm 3min

8、上清至新管,2倍体积预冷无水乙醇

9、-20C,20min,14000rpm, 15min

10、400ul 70%冷乙醇洗涤

11、干燥,100ul 20ug/ml RNaseA,37C,30min

12、2倍体积无水乙醇沉淀,70%冷乙醇洗涤

13、干燥,溶于100ul TE

介于方法一和方法二之间,CTAB虽然取出糖分效果较好,但CTAB本身也是有毒的,所以此方法放弃了CTAB。

革兰氏阳性菌,由于细胞壁的结构与阴性菌有差别,裂解比阴性菌稍微麻烦一些,可以采取CTAB/NaCl法稍加修改,在第四步加入终浓度2mg/ml的溶菌酶,37度温育1h。

实验注意:提基因组最好要将枪头尖剪掉(剪掉以后在酒精灯上迅速过一下,使其断口圆滑)。以免枪头损伤基因组!抽干时最好是风干!

(转载,仅供参考)

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第2个回答  2019-03-15
BIOG离心柱法
自行准备材料:无水乙醇、PBS水及1.5mL离心管。
取出析出液和洗涤液,按以下操作:
a) 析出液:4.5mL加入25.5mL无水乙醇;9mL加入51mL无水乙醇。
b) 洗涤液:9mL加入21mL无水乙醇;18mL加入42mL无水乙醇。
c) 配制好的析出液如出现沉淀,可在37℃溶解,摇匀后使用。
细菌处理:将收集的细菌5,000 rpm离心3分钟,弃上清,加入200μLPBS,振荡混匀,5,000 rpm离心3分钟,彻底弃上清。
a) 对于革兰氏阴性菌和一般的革兰氏阳性菌,加入200μL裂解液Ⅰ,悬浮沉淀,37℃放置30分钟。
b) 对于细菌壁较厚的革兰氏阳性菌、真菌、细菌芽孢等须首先自行进行破壁处理,处理结束后进行步骤5操作。
加入200 μL 裂解液Ⅱ,20μL消化液,充分振荡混匀,56℃水浴10 分钟。
加入600μL析出液,轻轻颠倒混匀,如有半透明悬浮物,不影响DNA的提取与后续实验。
将吸附柱放入收集管内,取上述溶液600μL转入吸附柱内,静置2 分钟,12,000 rpm 4℃离心1 分钟,弃收集管内废液。
将剩余400μL液体转入上述吸附柱内,重复操作步骤7。
将吸附柱放回收集管内,加500μL 洗涤液至吸附柱内,12,000 rpm 4℃离心1 分钟,弃收集管内废液。
将吸附柱放回收集管内,12,000 rpm 4℃离心2 分钟,离去残留的洗涤液。
取出吸附柱,放入新的1.5 mL 离心管内,加入50-200 μL 洗脱液,静置3分钟,12,000 rpm 4℃ 离心2分钟,收集DNA溶液。提取的DNA即可用于下一步实验或-20℃保存
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