DNA 复制有关酶
DNA聚合酶
DNA引发酶(PRIMASE)
是DNA合成中合成RNA引物的酶,引发酶行使2个功能:首先在起点处起始先导链的合成.其二在延伸中帮助岗奇片段的反复起始.
DNA解旋酶
DNA拓扑异构酶
单链结合蛋白(SSB)
核酸酶(nucleases)
是通过水解磷酸二酯键消化核酸的酶,包括DNase 和 RNase两类,各类还包括外切酶和内切酶两类.在复制中需要三个特定的核酸酶活性:校正需要3'-5'的外切酶活性,引物的去除需要RNaseH,5'-3'外切酶活性.
DNA连接酶
DNA连接酶是在双链DNA中催化相邻核苷酸形成磷酸二酯键的酶.她要求5'断的核苷酸必须有完整的磷酸基团,3'端必须有完整的羟基.在真核生物中连接酶需要ATP.DNA连接酶控制所有DNA修复途径的最后阶段,哺乳动物有4种连接酶活性,DNA连接酶I是涉及后滞链修复的基本酶.
非洲爪蟾卵提取物中MCM2-7复合物
在染色质上复制起始复合物周围的分布
摘要:MCM2-7复合物被认为具有真核生物DNA复制解旋酶功能.它通过复制起始复合物(ORC),CDc6,Cdt1而结合到DNA 链上,它在G1-S的过度期被CDc45和蛋白质激酶CDc7,Cdk2所激活.但是,在染色体上,结合的MCM复合物数量远比ORC复合物的数量多.为了弄清楚原因,本实验用非洲爪蟾(XENOPUS)卵提取物为材料,检测了结合在线性DNA片段上的各种蛋白质进行了测定.实验发现,当DNA片段为80bp时,ORC和MCM之比为1:1;当DNA片段较长时,MCM的比率迅速上升,证明MCM广泛分布在结合有CDc45的DNA周围.MCM复合物并不是DNA复制的限制物,
摘要(续)
它们在CDc7存在的情况下被磷酸化,他们能诱导Cdk2 依赖的CDc45的附着.非洲爪蟾卵提取物实验表明,DNA复制的起始包含着复杂的,分布广泛的,具有起始作用的MCM2-7复合物.
染色体DNA的复制需要三个系统参与
非洲爪蟾胚胎期细胞从有丝分裂末期至G1期末复制起始事件
固定在线性DNA碎片上的前复制复合物的形成和激活
ORC和MCM被有效地富集于82-bp以上的DNA片段上
MCM的附着与DNA长度有关,而ORC与DNA长度无关
侧位MCM复合物紧紧附着于染色质
附着于DNA上的CDC45是DNA复制的速度限制因素
MCM复合物的磷酸化是CDC7依赖的
CDC45在染色体上的附着受放线菌素D所促进
DNA复制起始模型
结论
一,MCM复合物的附着需要82bp的DNA片段,ORC的附着也需要80bp的DNA片段,被认为是G1期MCM附着所需的DNA长度.
二,DNA片段长度超过82bp时,MCM复合物的数量显著增加,而ORC保持不变;MCM复合物广泛分布在ORC周围的DNA片段上.
三,MCM复合物在DNA片段上的附着需要CDC6和CDT1.
在没有ORC,CDC6,CDT1存在的DNA片段上没有MCM附着.
四,MCM复合物附着后,ORC去除不会降低DNA合成的效率.ORC后的MCM具有支持复制起始的作用
结论(续)
五,侧位MCM复合物被CDC7结合,MCM4被CDC7依赖的反应磷酸化;在放线菌素D存在的情况下,CDC45:MCM约为1,表明每个侧位MCM可以招募一个CDC45.
六,DNA复制的起始事件被有规律地隔断,其原因是在CDC45附着的一定距离的MCM复合物处于不活动状态.
七,研究表明,MCM复合物在哺乳动物细胞中普遍存在,人类的细胞核中有106个MCM复合物;中国仓鼠卵巢细胞中MCM复合物在G1期增多,在GI/S期的过度期达到最高.
细胞周期是指由细胞分裂结束到到下次细胞分裂结束的时期.有增殖能力的细胞每增殖一次都要经过一个细胞周期.每个细胞周期都要经过间期和分裂期.真核细胞间期又分为G1期,S期和G2期,分裂期有分为前期,中期,后期,末期.GI期早期如果生长因子缺乏,细胞进入静止期G0期,如果细胞通过限制点(R),就进入下一轮复制和分裂.左图反映细胞成分的持续积累和DNA的非持续合成.
细胞周期的分子基础是一系列蛋白质和激酶所调控的.
连续精确的DNA合成需要很多酶活性协同作用.其中在复制叉中使DNA延伸的最重要的是细胞复制体复合物,它是酶和其他蛋白质的动态复合物.
真核细胞有四种细胞核DNA聚合酶和一种负责细胞器DNA基因组复制的多聚酶.DNA聚合酶α δ 负责染色体的复制, α 在后滞链上延伸RNA引物,为复制因子(RF-C)提供模板.DNA聚合酶δ合成先导链和后滞链,它与PCNA(增殖细胞核抗原)结合.DNA聚合酶β 是5个酶中最小的酶,其保真度和行进性最低,它涉及DNA的修复.DNA聚合酶γ 负责线粒体NDA的复制.DNA聚合酶ε的作用不十分清楚.
DNA解旋酶是沿单链DNA移动的酶,它利用ATP水解得来的能量打断氢键,分离双链分子.它只沿DNA一个方向移动,可根据他们5'-3'或3'-5'的极性分类.RF复制因子.
DNA拓扑异构酶是催化DNA拓扑异构体相互转换的酶.在真核细胞中,拓扑异构酶是细胞骨架的一部分,他们在有丝分裂中姐妹染色体的分离也起作重要作用.拓扑异构酶分成两类功能类型:I 型只剪切一条链,只能连接/去处含有缺口的地物.II 型可以同时剪切两条链,可以连接/剪切共价闭环链.
单链结合蛋白是缺乏酶活性的复制辅助蛋白,但是其他复制有关酶所必需的.它们在细胞内行使很多涉及单链区域稳定性的功能,在复制中包括稳定溶解起点,维持螺旋酶活性,从DNA模板上去除二级结构,抑制核酸酶活性等.Pol:聚合酶,ss酿酒酵母,RP-A1是酿酒酵母基因.
CDC 细胞分裂周期蛋白
CDK 细胞周期蛋白依赖激酶
MCM 酿酒酵母转录因子,
该图显示一小段染色体DNA片段如何跨过细胞周期.
第一系统:起始识别系统.该系统负责在DNA适当的位置复制起点.充当这一角色的是ORC,它被附吸在复制起始处,并行使起始功能,在这个间期ORC都结合在DNA上.
第二系统:复制准许系统.他保证这些"起始"在一个细胞周期仅激活一次.他在M期末激活,并支持MCM2-7复合物的附着,准许进入S期开始复制.
第三系统:S期促进因子(SFP).提供复制叉起始的触发器.他包括2种活性成分: CDc7蛋白质激酶,S期促进的细胞周期依赖激酶CDK.
蛋白质印迹法分析
(主要了解DNA和ORC,MCM的空间关系)
1道:当量的磁珠(未加DNA),检测不出MCM和ORC2
2-6道:磁珠被偶联到3kb的DNA蓝印碎片(通过PCR得来)上.然后和非洲爪蟾卵细胞溶质保温20分钟,通过分离,洗涤再用蛋白质印迹法分析.
2道表明有DNA片段存在时,能检测到MCM和ORC2
4道表明,加入GEMININ时,不能检测到MCM3(被抑制与瓷珠结合)说明MCM的附着是CDT1依赖的.
5道表明,NPE存在时CDc45与瓷珠结合增加.
6道表明,P27KIP存在时,CDc45检测不到,因为CDK2受到抑制,因而c45的附着需要CDK2.
了解ORC,MCM和DNA长度的关系
#A&B:一个251 bp的PCR产物跨越蓝印多接头被偶联到bead上, beads被不同的酶消化,产生251,154,120,94,67,和0 bp的DNA片段.消化后的DNA片段附着于bead上进行2%琼脂电泳分析(A)或与非洲爪蟾卵细胞溶质保温,然后附着于蛋白质上,通过蛋白质印迹法分析(B).(C)相同计量的DNA beads和非洲爪蟾卵细胞溶质保温(1-5加缓冲液,6-10加Geminin)然后用蛋白质印迹法分析. (D)通过定量对比发现,67 bp的DNA上没有MCM.94个bp时,MCM:OCR=1:1. (D)进一不了解到82个bp时是MCM附着的最短片段.
A表明,在0.3-6kb时,ORC的数量都没有变化,研究表明,10-15kb有一个ORC.另一方面,MCM3确随着DNA片段的延长含量显著增加.Geminin完全抑制MCM在DNA上的附着,但却加强ORC在DNA上的附着,切附着量随DNA片段的增加而增加.
B表明6kbDNA片段上,MCM3:ORC2与精子细胞中的一样高,约20-40:1.
C是为了解MCM2-7的其他亚基是否也和MCM3一样而设计的实验.首先偶联一个1kb的PCR产物在瓷珠上.一份被消化到100bp长度,一份不消化.结果表明:附吸到DNA片段上的ORC2在1kb和 100bp上相近.MCM3在100bp上低得多.MCM7和MCM4表现和MCM3一致.表明MCM2-7都是DNA长度依赖的.
D是了解在1kb上MCM3和ORC2的比例.用的是蛋白质印迹法.光密度计量法结果是11:1.暗示每个MCM3所需的DNA长度是90bp
该实验是要了解ORC前和ORC后MCM2-7复合物与DNA的相互作用是否通过同样的机制.实验是通过比较在仅含ORC后MCM复合物(6kb)和仅含ORC前MCM复合物(100bp)的两个片段上MCM复合物的附着坚固程度.
将他们防入1M KCL,发现无论1kb还是100bpDNA上,MCM复合物都被阻止与DNA结合,而ORC在0.6M KCL溶液中被阻止与DNA结合.试验结果与用精子DNA试验结果一致.表明ORC前后的MCM复合物都是盐抗的.
C表明:CDC-45与DNA长度没有关系.它是CDK-2依赖的.ORC2不依赖DNA片段长度.
实验表明只有一个MCM亚基对CDC45的附着起作用.
实验要了解多少数量的MCM复合物在精子染色体上招募的CDC45,使DNA模板在非洲爪蟾卵细胞完全复制.先要了解在精子细胞染色体中MCM3,ORC2和CDC45的比率.蛋白质印迹法,用已知量的CDC45,ORC2和MCM3做对照(A).
B是了解CDC45是否是DNA复制速率的限制因素.结果表明,DNA复制速率与CDC45的量有关,与CDC45在染色体上的附着情况有关.
C非洲爪蟾卵细胞核的组装和复制与MCM复合物无关.是否与径自细胞的DNA复制也无关 结果显示:在MCM复合物下降到50%时,附着到DNA上的MCM开始下降,到6%时就无法检测到.但加入NPE时,DNA复制与MCM浓度无关.
以往的研究表明:附着于染色体上的MCM4的磷酸化是通过CDK2依赖的蛋白质激酶实现的;非洲爪蟾卵抽提物中附着于染色体上的MCM4的磷酸化是在加入NPE后,且需要CDC7存在.
图6是精子细胞染色体,含MCM3:ORC2为20:1(6道).MCM4在加入NPE后4分钟全部磷酸化(2道).其结果与CDC7与侧位MCM2-7复合物的相互作用一致.证明结合于DNA上的MCM是被CDC7引导和修饰的.
MCN2-7复合物磷酸化被CDC45促进,但仅少量MCM复合物招募CDC45.是否所有的MCM复合物都被CDC45磷酸化 实验试图寻找在什么条件下,大多数MCM复合物都要招募CDC45.结论是:大多数MCM复合物与CDC45相互作用,CDC45的附着是CDK2,MCM2-7和CDC7依赖的.因此MCM复合物是支持复制起始的.
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