如何把外周血中的树突状细胞分离纯化

Question

如题所述

Answer 1

树突状细胞的培养，目前还没有传代的细胞柱，大家一般采取的是两种办法，一种是从组织分离，主要应用的是细胞磁珠经过纯化，然后配取合适的培养基进行诱导培养。
另一个就是单纯的联合诱导培养，我就是采用这个方法。具体的protocal如下：C57BL/6小鼠，6～8周龄，雌性，体重18～20g，购自北京军事医学科学院动物中心。细胞因子rmGM-CSF及rmIL-4为美国Peprotech公司产品。CD11C+细胞磁珠分离纯化试剂盒为德国Milentyi公司产品。
1． 采用断头术处死小鼠，在75％的酒精中浸泡2－3min后，置于无菌平皿中，剪开皮肤。取出双侧股骨，用无菌的生理盐水（或RPMI－1640代替）刷洗2－3次后剪开骨两端，用1ml的注射器抽取RPMI－1640液，将骨髓细胞冲入15ml离心管中。
2． 将骨髓细胞轻轻吹打，使细胞完全悬浮，静置五分钟，然后转入另一个15ml离心管中，离心，1200rpm，10min 。
3． 弃上清，细胞沉淀按1：10加入Tris-NH4CL缓冲液，轻轻吹打混匀，室温放置五分钟。
4． 离心后，弃上清，细胞沉淀用RPMI－1640洗涤两遍。
5． 细胞计数，用RPMI－1640调整细胞浓度为0.5-1×105 ／ml，置于六孔培养板中，每孔2ml。
6． 37℃，5％CO2，饱和湿度下贴壁2－3h
7． 吸弃上清，用37℃预温的RPMI－1640轻轻洗去非贴壁的细胞，每孔加入2ml的完全培养液继续培养。
8． 隔日半定量换液，小心弃去悬浮细胞，轻轻转动培养板，防止细胞凝集。第七天收集悬浮细胞，做相关的实验。
按照如此方法培养的细胞效果相当好。一般流式检测可以达到80％的纯度。