目的 探讨活体细菌着色检测的适宜条件。方法 将金黄色葡萄球菌、黄色微球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌稀释浓度为5×107菌落形成单位/毫升 (Colony forming unit，CFU/ml)。 经不同浓度与作用时间的结晶紫(Crystal Violet , CV)着色细菌洗涤后，保存于甘油磷酸缓冲液。采用平皿倾注法测取细菌的CFU。结果 与对照组相比，2%CV染色时，细菌CFU无显著性差异（P>0.05），染料大于此浓度染色时，CFU有差异性（P<0.05）。染色时间在3min内CFU无显著性差异（P>0.05）。30%甘油磷酸盐缓冲液保存着色活体细菌，在48h内活性无显著性差异（P>0.05），60h后有差异性（P<0.05）。结论 实验方法适用于活体细菌显色法的形态学检测。
结晶紫活体细菌染色
THE EXPERIMENTAL STUDY OF THE LIVING BACTERIA
BY CRYSTAL VIOLET STAINING
Lu Dongming，Yang Dawu, Zhong Zhiqun， Li Yanjun
Qinghai University Medical College
Abstract Objective To explore an appropriate condition for the examination of the living bacteria staining. Methods The culture of Staphylococcus aureus, Micrococcus flavus, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa were collected and then centrifugally washed. The final concentration is 5×107 colony forming unit/milliliter(CFU/ml) diluted by normal saline(NS). The four strains of bacteria were preserved in the glycerophosphate buffer after being dyed and laved by the different concentration and acting time of crystal violet. In order to know the effect of various factors such as staining solution concentration, acting time, and glycerin buffer fabrication upon the bacterial survival rate, and two methods were carried out. One was observed by the microscope, the other was put into the culture dish. Results Comparing with that of the control group, the bacterial CFU was had no statistical significance (P>0.05) dyed by 2% crystal violet. When the concentration of the dye-solution was higher than 2%, there showed the difference (P<0.05). In 3 min dyeing time, CFU had no significant difference (P>0.05). The stained living bacteria preserved in the 30% glycerophosphate buffer within 48h have not shown significant difference (P>0.05),while after 60h, it showed significant difference (P<0.05). Conclusion The method is quite suitable for the morphological detection of the living bacteria.
Key Words Crystal Violet Living bacteria Staining
染色法着色灭活菌是细菌形态学检测的常用方法，广泛应用于临床实验室。而活体细菌的着色检测有实际应用价值。为此我们首次通过苯胺染料结晶紫染色细菌，探讨活体细菌着色的最佳浓度和染色时间，并对细菌保存液加以改进，旨在为活体细菌染色的形态学检测建立方法。 1.1 材料
1.1.1 实验菌种：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌（质控菌种， 转种于青海省第一人民医院检验科），黄色微球菌（实验室自备）。
1.1.2 主要试剂与器材：CV染料配制;称取CV 2.0 g、2.5 g、3.0 g和3.5 g分别溶于95%无水乙醇10 ml ，加入90 ml 0.8%草酸铵溶液，制备成不同浓度的染液。 30%甘油磷酸盐缓冲液配制：纯甘油30 ml，1%磷酸钠溶液70 ml，硫代硫酸钠10 mg。5×107 CFU/ml麦氏细菌比浊管 购自青海省医药公司。营养琼脂培养基购自上海生物制品所。CX21型Olympus生物显微镜，日本产；SPE-250BS型细菌生化培养箱，上海产。
1.2 方法
1.2.1 实验细菌分组与处理：将金黄色葡萄球菌，黄色微球菌，大肠埃希菌和铜绿假单胞菌制备成菌液，经NS离心（4000r/min 10min）洗涤3次。根据文献[1]用NS配制各细菌浓度（5×107CFU/ml）。实验组每种细菌各分4株,均以8ml分装于10ml试管内, 离心（4000r/min 10min）留取细菌沉淀物0.5 ml,加入染液0.5 ml 染色。设CV为2.0%、2.5%、3.0%和3.5%浓度染色组。经离心洗涤后,加入30%甘油磷酸盐缓冲液8 ml保存备用。对照组不加染液以同样方法操作。
1.2.2 指标检测： CV浓度和染色时间与细菌存活率及甘油磷酸盐缓冲液对细菌活力影响测定,均采用平皿倾注法。细菌动力检测采用(悬滴法)镜下观察。
1.2.3 统计学方法：两组实验数据以均数±标准差(x±S)表示,组间比较采用方差分析和Dunnett检验。 2.1 结晶紫耐性实验结果（见表1～2）
2%浓度染色细菌3 min时活性不减，与对照组相比CFU无显著性差异（P>0.05）。在革兰氏阳性菌染料浓度>2.5%、阴性菌>3.0%、染色时间>4 min染色时，细菌CFU有差异性（P<0.05）。 表1细菌在不同浓度CV着色时的活性比较结果 注：*与对照组相比有统计学意义（P<0.05）.表22%CV不同着色时间的细菌存活率比较结果注：*与对照组相比有统计学意义（P<0.05）
2.2 甘油磷酸盐缓冲液对细菌活性影响（见表3～4）
甘油浓度50%时CFU有差异性（P0.05）。而由30%甘油磷酸盐缓冲液所保存的着色细菌在48 h内其活性无显著性变化（P>0.05），60 h后有变化（P<0.05）。表3不同甘油浓度的磷酸盐缓冲液对着色菌活性影响比较结果（ 注：*与对照组相比有统计学意义 （P<0.05）.表430%甘油缓冲液保藏着色菌的存活率比较结果 注：*与对照组相比有统计学意义 （P<0.05）. CV是分子量为408da的人工苯胺染料,分子中有色基团通过正电荷的助色基团与细菌胞浆中带负电荷的多相胶体成分静电亲和而着色,高浓度结晶紫可抑制细菌代谢的重要酶蛋白,成为导致细菌着色后灭活的重要因素[2]。故着色细菌的活性与染料浓度、染色时间密切相关。我们通过结晶紫染料耐性实验表明,将2%CV着色革兰阳性菌的葡萄球菌和黄色微球菌与革兰阴性菌的大肠埃希菌和铜绿假单胞菌染色3 min并保存于改良的30%甘油磷酸盐缓冲液中。 着色细菌镜下观测保存液中其细菌胞浆色泽均匀、动力及活性在48 h内无显著性差异（P>0.05）。 适用于实验室活体细菌染色法的形态学检测,以及活体细菌色泽标记的生物学研究。
实验中发现着色细菌60 h后对染料有不同程度的脱色作用(着色细菌色泽逐渐变淡,细菌保藏液色泽变浓),我们认为是活体细菌通过胞吐作用外排染料的结果,这可能也是着色细菌得以存活的重要机制。其原因为着色的活体细菌在代谢过程中产生的有机酸改变了细菌胞浆内等电点,使着色染料与胞浆中多相胶体成分解离所致。
GENMED结晶紫细胞群落染色试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
GENMED结晶紫细胞染色试剂是一种旨在使粘附生长的单细胞层细胞（群落）摄取结晶紫染料而获得细胞繁殖密度定量信息的广谱染色材料和权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明、顶级杂志推荐的。其适用的细胞是呈单细胞层（Monolayer）生长的人体和动物细胞。产品严格无菌，即到即用，性能长期稳定，细胞着色率100%。
技术背景
结晶紫也可称之为龙胆紫。当它溶解后，可以被活细胞摄入。同时可以使DNA、蛋白质、脂肪着色。染色显示细胞核呈蓝色，细胞质呈粉红色。肉眼显示整个细胞呈深蓝色。在分光光度计或酶标仪上可以进行定量分析以评价细胞生长繁殖情况。
产品内容
GENMED清理液（Reagent A） 毫升
GENMED染色液（Reagent B） 毫升
GENMED溶解液（Reagent C） 毫升
产品说明书 1份
保存方式
GENMED清理液（Reagent A）保存在4℃冰箱里，其余的保存在室温下；GENMED染色液（Reagent B），避免光照，有效保证1年
用户自备
封口膜：用于密封培养板后长期保存
显微镜：用于观察细胞染色情况
分光光度计：用于定量检测细胞生长繁殖情况
实验步骤
1． 小心抽掉多孔细胞培养板里的培养液
2． 轻轻加入适量的GENMED清理液（Reagent A）到每个培养孔里（见下表） 多孔培养板 容量 3． 小心抽去清理液
4． 加入适量的GENMED染色液（Reagent B）到每个培养孔里（见下表） 多孔培养板 容量 5． 在室温下静置 分钟
6． 抽去GENMED染色液（Reagent B）
7． 重复实验步骤 和 三次，培养孔显示粉红色
8． 抽去所有液体，倒置培养板在纸巾上，使其吸干培养孔里的残存液体
9． 肉眼或显微镜观察：细胞核呈蓝色，细胞质呈粉红色。整个细胞呈深蓝色
10．用封口膜密封培养板，在室温下长时间保存
11．如果重新启封观察，发现样本干枯或收缩，只需加上适量的GENMED清理液（Reagent A）则可
12．如果需要定量测试，加上适量的GENMED溶解液（Reagent C）（见下表） 多孔培养板 容量 13．轻轻摇动培养板，直到GENMED溶解液（Reagent C）均匀分布
14．在室温下，孵育 分钟
15．即刻放进分光光度计测读，波长为 nm
注意事项
1． 本产品为250次（24孔板）、500次（48孔板）、1000次（96孔板）操作
2． 细胞染色前后的清洗过程中，小心操作，以免将细胞冲洗掉，而影响定量分析
3． 在细胞清洗过程中，可以将培养板整个翻转，一次性倾倒其染色液和清洗液
4． 本公司提供系列细胞繁殖检测试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能长期稳定
2． 本产品经鉴定效果满意，细胞固着力强，着色率100%
