1504年，卡斯蒂利亚女王伊莎贝拉一世病逝，她的女儿胡安娜（又称“疯女胡安娜”）继承了王位。卡斯蒂利亚的菲利浦一世，神圣罗马帝国马克西米连一世之子，以胡安娜的丈夫身份成为监国者。
1516年，斐迪南二世去世后，卡洛斯（查理五世，西班牙文名）作为特拉斯塔马拉家族的外孙，凭借资格成为西班牙（卡斯蒂利亚和阿拉贡）的统治者，他虽然来自哈布斯堡家族，却因缺乏魅力、经验以及不会说西班牙语而引发了担忧。初到西班牙，卡洛斯的选择并未赢得好感，如任命弗兰德斯顾问为托莱多大主教，试图增税等，这引发了贵族的不满。
1519年，卡洛斯成为神圣罗马帝国皇帝，然而他前往德国的计划因国内赋税重和叛乱而受阻。平民大暴动在托莱多爆发，反对卡洛斯的统治，要求胡安娜复位并强调行政职位的本地化。贵族的犹豫不决最终导致维亚拉战役的胜利，叛乱平息，赋税问题暂时解决。
在卡洛斯一世统治期间，美洲的开发开始加速，他资助了麦哲伦的环球航行，西班牙在美洲建立了多个殖民总督区，财富如潮水般流入。然而，海外战争的巨额开支使得西班牙经济陷入困境，他们不得不依靠美洲的金银做抵押贷款，这导致了经济衰退和竞争力的下降。
宗教改革时期，查理五世支持天主教，对抗新教，但西班牙国内出现了反宗教改革运动，书籍被查禁，人文主义理念被质疑。1556年，查理五世为德意志的纷争做出选择，退位并划分领土，西班牙哈布斯堡王朝的格局由此形成。
西班牙历史上的哈布斯堡王朝，是指1556年至1700年间统治西班牙，西属尼德兰和意大利部分公国和1580年至1640年间统治葡萄牙的家族。西班牙哈布斯堡王朝与奥地利哈布斯堡王朝同宗，而其母系祖先分别为卡斯蒂利亚女王伊莎贝拉一世和阿拉贡国王斐迪南二世，他们都是特拉斯塔马拉家族的成员。而在1700年后继承西班牙王位的都是波旁家族的成员。