基因文库的构建涉及到基因组大小(G)、片段大小(?), 以及出选某基因的概率(p)和总克隆数(N)之间的复杂关系。为了确保随机性和片段的连接便利，DNA片段的制备通常采用随机性较高的方法，如机械剪切，尽管这可能导致两端无粘性末端。相比之下，限制性核酸内切酶虽然随机性较差，但其产生的片段具有粘性末端，便于与载体相连，如在重组DNA技术中常见。
基因载体的选择取决于待克隆的DNA片段长度。对于原核生物基因文库，由于基因组较小，可以使用较短的质粒，如pBR322。然而，对于真核生物，基因结构复杂，含有内含子，这使得需要更长的DNA片段以确保完整基因的克隆，此时常用改建的噬菌体如λCharon4A（可容纳8.2-22.2kb的外源DNA）或者粘性质粒，如pHC79（可容纳37-50kb的外源DNA）作为载体。
DNA片段通过噬菌体T4连接酶或大肠杆菌连接酶与载体进行共价连接，形成杂种DNA分子。对于质粒载体，通过转化技术可将重组DNA分子引入细胞；而λ噬菌体的DNA载体则需经过离体包装，先将其包在噬菌体外壳中，然后通过噬菌体感染细菌细胞，这个过程的效率远高于直接转染，可以高出几十到几百倍。
一个生物体的基因组DNA用限制性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到载体DNA分子中，所有这些插入了基因组DNA片段的载体分子的集合体，将包含这个生物体的整个基因组，也就是构成了这个生物体的基因文库。