第1个回答 2024-08-12
一、WB实验介绍
WB（Western Blot，蛋白免疫印迹）技术是一种常见的蛋白分析手段，常用于鉴定特定蛋白，并进行定性和半定量分析。
该实验的核心原理是抗原与抗体之间的特异性结合。通过变性胶SDS-PAGE分离不同分子量的蛋白质，然后将其转移到固相载体PVDF膜上。随后，使用脱脂牛奶作为封闭液和一抗稀释液进行封闭和稀释。待目的蛋白与抗体结合充分后，用TBST洗脱液洗去未结合的一抗，加入带有HRP标记的二抗。此时，蛋白、一抗和二抗形成复合物，加入化学发光液，有靶蛋白的位置会产生荧光，利用胶片或化学发光仪即可显现靶蛋白条带。
WB常规实验流程：蛋白提取→蛋白定量→制胶→电泳→转膜→封闭→一抗孵育→一抗洗脱→二抗孵育→二抗洗脱→化学发光→数据分析。
二、WB实验试剂配置
在实验开始前，需按以下配方比例配置实验所需试剂。
1.电泳缓冲液：将电泳缓冲液干粉（G2018-1L）溶解于1L纯水（G4701-500ML）中，置于磁力搅拌器（MS-150）上充分搅拌溶解。
2.转膜缓冲液：取转膜缓冲液干粉（G2017-1L），溶解于800mL纯水中，加入200mL甲醇，置于磁力搅拌器上充分搅拌溶解。
3.TBST缓冲液：取TBS粉剂（G0001-2L），溶解于2L纯水中，加入1mL吐温20，置于磁力搅拌器上充分搅拌溶解。
4.5%脱脂牛奶：称量5g脱脂奶粉（G5002-100G），溶解于100mL TBST溶液（G0004-500ML）中，置于磁力搅拌器上搅拌至少30分钟，然后放入4℃冰箱暂存。
5.完全裂解液：1mLRIPA裂解液（G2002-100ML或G2033-100ML）+20μL cocktail（G2006-250UL）+10μL磷酸化蛋白酶抑制剂A（G2007-1ML）+10μL磷酸化蛋白酶抑制剂B（G2007-1ML）+10μL PMSF（G2008-1ML），除RIPA外，其他四种试剂使用前几分钟加入，现配现用。
三、WB实验步骤
由于篇幅限制，本文先介绍组织或细胞的蛋白提取和蛋白定量常规流程。
蛋白提取：
1.组织总蛋白提取：准备好所需数量的样本管，放入研磨珠，置于冰盒备用。组织块先用预冷PBS洗涤2-3次，除去血污，放在滤纸上吸干多余的PBS后放入匀浆管中，加入约10倍样本体积的完全裂解液，置于组织研磨仪中，对称放置，确认平衡后，盖好盖子，选择程序开始匀浆。
2.悬浮细胞提取蛋白：将细胞连同培养基一起吸入15mL离心管（EP-1501-J）中，4℃，2000rpm，离心5分钟，去掉上清；加入1mL PBS溶液（G4202-500ML）重悬细胞，转移到1.5mL离心管（EP-150-M）中，然后4℃，2000rpm，离心5分钟，去掉上清，保留沉淀，重复此步骤2-3次（此步骤目的为清洗细胞中残留的培养基）；根据细胞沉淀的量加入适量的完全裂解液，例如沉淀体积为绿豆大小（大概10uL左右）的加入大约200μL完全裂解液，加入适量研磨珠，放入研磨仪进行裂解；裂解完成后，12000rpm，4℃，离心10分钟，上清即为总蛋白溶液。
3.贴壁细胞提取蛋白：倒掉培养基，沿细胞培养皿侧壁或培养瓶瓶口慢慢加入PBS溶液，轻轻晃动平皿或培养瓶，然后将细胞培养皿/瓶倾斜放置，用移液枪轻轻吸除残余液体，尽量轻柔，不要将细胞冲掉，清洗2-3次，最后一次将残余PBS完全吸干；加入适当体积的完全裂解液（例如六孔板各单孔细胞长满的话，加入约250μL完全裂解液），反复晃动细胞培养皿/瓶，让裂解液与细胞完全接触，用细胞刮刀将细胞刮下来，收集后，加入研磨珠，放入研磨仪中进行裂解；裂解完成后，12000rpm，4℃，离心10分钟，上清即为总蛋白溶液。
蛋白定量：
取适量上述步骤中未变性的总蛋白溶液，用BCA蛋白定量检测试剂盒（G2026-200T；G2026-1000T）测定蛋白浓度，蛋白浓度测定方法如下：
A.配制蛋白标准储备液：取1mL蛋白标准配制液加入到蛋白标准品（BSA）蛋白标准管中，将25mg蛋白标准品完全溶解，即得到浓度为25mg/mL的蛋白标准储备液。配制成的蛋白标准溶液可在-20℃长期保存。
B.配制蛋白标准工作液：取适量25mg/mL蛋白标准储备液，用PBS或生理盐水稀释50倍，得到终浓度为0.5mg/mL的蛋白标准工作液。注意稀释时按照10倍梯度方法稀释，确保稀释准确。
C.绘制标准曲线（酶标仪法）：将蛋白标准工作液分别按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板中，然后用PBS或生理盐水依次加20、19、18、16、12、8、4、0μL将上述梯度工作液补足到20μL。得到蛋白浓度依次为0、25、50、100、200、300、400、500μg/mL的梯度曲线。
D.准备待测样品：将待测的蛋白样品进行适当稀释（可通过预实验检测，使样品蛋白浓度在标准曲线范围内，确保检测结果可信），按照每个样品20μL的量加到96孔板中。待测样品与蛋白标准品用相同溶液稀释。
E.配制BCA显色工作液：将BCA试剂与硫酸铜溶液按照50:1体积比充分混合均匀，得到BCA显色工作液。BCA显色工作液可室温保存，24小时内使用。每个待测样品需200μ
L，建议按需配制，避免浪费。
F.检测：向标准曲线样品孔及待测样品孔中每孔加入BCA显色工作液200μ
L，充分混匀（可将96孔板放在振荡器上振荡30s），37℃反应30min后，以标准曲线0号做参比，在562nm波长下比色测定，记录各孔吸光度值。（注：也可以在室温反应2h，或60℃反应30min。如果蛋白浓度较低，建议置于60℃反应）
G.计算：以标准曲线中梯度蛋白含量（μg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应孔中待测样品的蛋白浓度（μg/mL），再乘以样品稀释倍数即为待测样品实际蛋白浓度。
Tips：1.BCA法测定蛋白浓度受温度和时间的影响较大，吸光度值会随着时间的延长或温度升高而变化，如果不能精确控制显色反应的时间和温度，建议每次测定都需要做标准曲线。
2.在进行蛋白标准储备液的配制时，需确保溶解充分。稀释配制蛋白标准工作液时建议10倍梯度稀释，不要一次稀释50倍，以免产生较大误差。
3.为保证蛋白的精确定量，样品的提取和蛋白标准品的稀释配制最好选用相同的缓冲液，同保证两者检测条件一致。如果缓冲液本身就有较高的背景值，建议使用其他的方法测定。
4.操作时请穿实验服，并佩戴一次性手套。