第1个回答 2016-05-10
不同细菌所具有的酶系统各不相同，对营养物质的利用能力各异，它们在代谢过程中所产生的代谢产物也不同，通常用化学或生物化学方法检测细菌的代谢产物，有助于细菌属、种的鉴定。这种利用生化方法来鉴别细菌的实验，称之为细菌生化反应，是鉴定细菌的重要方法之一。通过本次实验，要求熟悉常用生化实验原理，掌握其方法、结果判定及其意义。
1 单糖发酵实验
不同微生物分解利用糖类的能力有很大差别，有的能利用有的不能利用，能利用者，又可分为产气或不产气。可用指示剂及各种发酵管进行检测。
本实验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别。每次生化实验，常需同时接种多管不同生化反应管。根据生化反应管的不同加不同指示剂，常用的指示剂有酚红、溴甲酚紫，溴百里酚蓝等。
【材料】
1．菌种：大肠埃希菌、伤寒沙门菌
2．培养基：葡萄糖、乳糖发酵管（内置倒管）或半固体培养基
【方法】
无菌操作，用接种环将上述两种细菌接种葡萄糖及乳糖发酵管各一支；若为液体培养基，用接种环沾取少许细菌接种，置37℃培养18～24小时后观察结果。观察培养基颜色有无改变，小倒管中有无气泡；若为半固体培养基，则用接种针接种，观察穿刺线、管壁及管底有无微小气泡，细菌有无动力，有动力时，细菌在培养基中沿穿刺线呈毛刷样生长。
【结果】
观察结果时，首先确定有无细菌生长，有细菌生长时，培养基常呈混浊状。然后确定细菌对糖类分解情况，如发酵糖类产酸，则培养基中酸碱指示剂变成其酸性颜色，可用“+”号表示。如发酵糖类产酸又产气，此时培养基除变色外，在倒置小管中有气泡出现，可用“ ”表示。如细菌不分解该糖时，则指示剂不变颜色，倒置小管无气泡，以“－”表示之。注意实验时仔细观察两种细菌对两种糖的发酵情况，并记录好结果。
2 IMViC实验
通常将吲哚实验（I）、甲基红实验（M）、VP（Vi）实验、枸橼酸盐利用实验（C）称为IMViC实验，主要用于鉴别肠杆菌科各个菌属，特别是大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别。
一、靛基质实验
某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚等产物。吲哚可用显色反应检测，吲哚能与对二甲基氨基苯甲醛结合，生成红色化合物玫瑰吲哚。
实验证明靛基质试剂可与17种不同的靛基质化合物作用而产生阳性反应，实验前若先用二甲苯或乙醚等进行提取，再加试剂，只有靛基质或5-甲基靛基质在溶液中呈现红色，因而结果更为可靠。
【材料】
1．菌种：大肠埃希菌，产气肠杆菌斜面培养物
2．培养基：蛋白胨水培养基
3．试剂：吲哚试剂
【方法】
将上述两种细菌分别接种于蛋白胨水培养基中，置37℃培养18～24小时后，沿管壁缓慢加入吲哚试剂0.5 mL（2～3滴），使试剂浮于培养物表面，形成两层，立即观察结果。
【结果】
两液面交界处呈现红色时为阳性，无变化者为阴性。
二、甲基红实验
有些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸继续分解生成乳酸、甲酸、乙酸等产物，由于产生大量有机酸，培养基pH下降至4.5以下，加入甲基红指示剂时呈现红色。而有些的细菌如产气肠杆菌，由于分解葡萄糖时产酸量少，加上产生的酸进一步转化为其它物质如醇、酮、醛等，培养基的pH维持在5.4以上，加入甲基红指示剂时呈黄色。甲基红为酸性指示剂，pH变色范围为4.4～6.0。故在pH 5.0以下，随酸度增加而显红色，在pH 5.0以上，则随碱度增加而呈黄色，在pH5.0或上下接近时，可能变色不明显，此时应延长培养时间，重复一次实验。
【材料】
1．菌种：大肠埃希菌，产气肠杆菌斜面培养物
2．培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基
3．试剂：甲基红试剂（pH变色范围为4.4～6.0）
【方法】
将两种细菌分别接种于上述培养基中，置37℃恒温箱中培养18～24小时后，各取2 mL培养液，加入甲基红试剂2滴，轻摇后观察。
【结果】
出现红色反应为甲基红实验阳性，黄色为甲基红实验阴性。
三、VP（Voges－Proskauer）实验
某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧生成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中O2氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基化合物反应生成红色化合物，称V－P（＋）反应。本实验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。用于芽胞杆菌和葡萄球菌等其它细菌鉴别时，普通培养基中的磷酸盐因阻碍乙酰甲基甲醇的产生，操作时应省去或以NaCl代替。
【材料】
1．菌种：大肠埃希菌，产气肠杆菌斜面培养物
2．培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基
3．试剂：VP试剂（6% α－萘酚乙醇溶液，40% 氢氧化钾溶液）
【方法】
将细菌分别接种于上述培养基中，置37℃恒温箱中培养24～48小时后，分别取2 mL培养物，加入6%α－萘酚乙醇溶液1 mL，再加入40%氢氧化钾溶液0.4 mL，充分振荡后，室温下静置5～30分钟观察结果。
【结果】
呈红色反应为阳性，如无红色出现，且置37℃4小时仍无红色反应者为阴性。
本实验常与甲基红实验一起使用。本实验阳性，甲基红实验阴性，反之亦然。
四、枸橼酸盐（Citrate）利用实验
枸橼酸盐培养基中不含任何糖类，枸橼酸盐为唯一碳源，磷酸二氢铵为唯一氮源。如果细菌能利用铵盐作为唯一氮源，并能利用枸橼酸盐作为唯一碳源，则可在此培养基上生长，分解枸橼酸钠，生成碳酸钠，使培养基变碱，此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。
【材料】
1．菌种：大肠埃希菌，产气肠杆菌斜面培养物
2．培养基：枸橼酸盐斜面培养基
【方法】
将细菌分别接种于上述培养基斜面上，于37℃培养1～4天，每日观察结果。
【结果】
培养基斜面上有细菌生长，而且培养基由绿色变深蓝色者为阳性；无细菌生长，培养基颜色不变，保持绿色为阴性。
观察并记录以上实验结果。
3 硫化氢实验
有的细菌能分解培养基中含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸），生成硫化氢，硫化氢遇铅或铁离子形成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物。该实验在肠杆菌科的细菌生化鉴别中有重要作用。
【材料】
1．菌种：大肠埃希菌，普通变形杆菌。
2．培养基：醋酸铅或克氏铁琼脂培养基。
【方法】
将细菌分别接种于上述培养基中，置37℃恒温培养箱中培养1～2天后，观察并记录结果。
【结果】
醋酸铅培养基出现黑色沉淀为阳性。不变色为阴性。克氏铁琼脂在底层和斜面交界处出现黑色沉淀者为阳性，不变色为阴性。普通变形杆菌：＋，大肠埃希菌：－。
4 脲酶实验
有些细菌能产生脲酶，分解尿素产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，使酚红呈现粉红色。脲酶不是诱导酶，因而不论底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。其最适pH为7.0。主要用于肠杆科细菌的鉴定。
【材料】
1．菌种：大肠埃希菌、普通变形杆菌。
2．培养基：尿素培养基
【方法】
将细菌分别接种于尿素培养基中，置37℃恒温培养箱中培养18～24小时后，观察并记录结果。
【结果】
培养基变红色者为阳性，不变色者为阴性。
5 微生物自动分析
常规细菌学检查，需首先将标本进行分离纯化，取纯化后的细菌进行一系列的鉴定，包括形态学检查、生化反应、血清学反应等，由于手续烦琐，分析周期长，且由于是手工操作，造成质量难已保证，虽然后来出现了各种商品化的检测试剂及培养基，但仍不能从根本上解决上述问题。20世纪70年代后，微生物学家与工程技术人员密切合作，发明制造了许多快速的细胞培养分析系统，使原来缓慢烦琐的手工操作变成了简单的自动化操作，缩短了工作时间，提高了工作效率及培养阳性率。
一、微生物自动分析的原理
微生物鉴定的自动化系统大致分为两大类：一类是自动血液培养检测和分析系统，即检测血标本中是否有细胞存在；另一类是自动微生物鉴定及药敏系统，即将分离的细菌进行生化实验加以鉴定，并进行抗生素的敏感性实验。
（一）自动血培养检测及分析系统的工作原理
自动血培养仪的工作原理分为以下三种：
1． 检测培养基导电性质和电压的变化进行微生物的分析
培养基中因含不同电解质而具有一定的导电性，微生物在生长代谢过程中可产生质子、电子和各种带电荷的原子团［如在液体培养基中二氧化碳（CO2）转变成CO3-］，通过电极检测培养基的导电性或电压改变即可判断有无细菌的生长。
2． 应用测压原理进行微生物的分析鉴定
很多需氧菌在胰酶消化大豆肉汤中生长时，由于需消耗培养瓶中的氧气，故首先表现为吸收气体，而厌氧细菌生长时，最初无吸收气体的现象，仅表现为产生气体［主要是二氧化碳（CO2）］，因此利用培养瓶内气体压力的改变即可检测微生物的生长情况。
3． 利用光电原理监测的细菌检测和分析系统
微生物在代谢过程中必然会产生终代谢产物二氧化碳（CO2），引起培养基pH下降，氧化还原电位的改变，利用光电比色检测血培养瓶中某些代谢产物量的改变即可判断有无微生物的生长。
（二）细菌自动鉴定及药敏系统
1．工作原理
（1） 鉴定原理
采用数码鉴定原理。如VITEK－AMS中每个用于鉴定的测试卡内有30项生化反应，每3项生化反应为一组，第1项生化反应阳性值为“4”，第二项反应阳性值为“2”，第三项反应阳性值为“1”，各项反应阴性记为“0”。将每组3项反应的阴、阳性结果转换成数值并相加，如3项生化反应全部为阳性，其组值为“7”。第1、3项生化反应为阳性，组值为“5”，依此类推。将各组反应的组值相加，30项生化反应可得到一组10位数的生物数码，在鉴定时有时还需外加补充实验，共可获得11位生物数码。而MicroScan的WalkAway系列则采用8进制计算法分别将28个生化反应转换成8位生物数码。计算机系统自动将这些生物数码与碥码数据库进行对比，获得相似鉴定值。
微生物自动鉴定系统的鉴定板包括常规革兰阳（阴）性板和快速荧光革兰阳（阴）性板两种，其检测原理各不相同，常规革兰阳（阴）性板对各项生化反应结果（阴性或阳性）的判定是根据比色法的原理，将菌种接种到鉴定板后进行培养，由于细菌各自的酶系统不同，新陈代谢的产物也有所不同，而这些产物又具有不同的生化特性，因此各生化反应的颜色变化各不相同。仪器自动定时测定每一生化反应孔的透光度，当生长对照孔的透光度达到终点阈值时，指示已完成反应。快速荧光革兰阳（阴）性板则根据荧光法的鉴定原理，荧光物质均匀地混在培养基中，将菌种接种到鉴定板后，通过检测荧光底物的水解、底物被利用后的pH变化、特殊代谢产物的生成和某些代谢产物的生成率来进行菌种的鉴定。
（2） 药物敏感实验的测试原理
药敏测试板的药物敏感性实验的实质是微型化的肉汤稀释实验，采用回归法测定最低抑菌浓度（MIC）。每一种药物一般选用3种不同药物浓度，仪器每隔一定时间自动测定小孔中细菌生长状况，得出待检菌在各药物浓度的生长斜率，经回归分析得到MIC值，并根据NCCLS标准得到相应敏感度。
药敏测试板也分为常规测试板和快速荧光测试板两种。常规测试板的检测原理为比浊法，即由于细菌生长情况不同而引起菌液浊度的变化，通过检测浊度来确定MIC值；快速荧光测试板的检测原理为荧光法，通过检测荧光的增加间接地测定MIC值。
二、大肠杆菌的自动分析仪分析
【材料】
1．MicroScan主机：MicroScan微生物自动分析系统主要由主机，软件系统，各种鉴定板（革兰阳性板、革兰阴性板，酵母菌板、厌氧菌板及HNID板），各种药敏实验板，专用取菌针， RENOK系统（用于将细菌悬液加入各种反应板中）等。
2．大肠杆菌肉汤培养物
3．革兰阴性菌鉴定板
4．革兰阴性药敏板
5．专用取菌针
【方法】
1． 从包装中取出反应板，要注意包装内如没有干燥剂或板的外包装有破损均不可使用。
2． 氧化酶实验：在接种板前，先进行氧化酶实验，把结果记录在对应的工作单上。
3． 细菌悬液的配制：使用一校准过的专用取菌针沾取3～5个菌落，用环状的盖帽将针边缘上多余的细菌刮掉，将取菌针插入专用的prompt接种水瓶中，彻底混匀再接种。
4． 应用专用的RENOK系统在板孔中接种细菌悬液，每孔105～115 μL。
5． 滴加无菌矿物油：在GLU、URE、H2S、LYS、ARG、ORN和DCB孔中加入三滴矿物油。
6． 加密封条：对氧化酶阳性细菌，在CIT、MAL、ONPG、TAR、ACE、CET、OF/G和DCB孔上放置密封条，在DCB孔上密封条留一1/4英寸的定位孔。
7． 培养：将板置35℃非CO2培养箱中培育16小时左右。
8． 读板：将板置MicroScan测试设备中读板，计算机自动打印结果。
【注意事项】
1． 如果干板是储存于冰箱中，则要立即从锡纸包装中取出干板，并让其平衡至室温后再水化，然后再加一干净的盖，已打开包装的板应在同一天内使用。
2． 接种时，同时将被试悬液划线接种到一血平板上，16～20小时培养后，如果平板上出现两种或以上菌落形态，则必须重新测定。
3． 加矿物油时，孔中的培养基必须被矿物油完全封盖，但不能使矿物油流出孔外。
4． 孵育时，为防止水分蒸发，在反应板上放置一块干净的盖板。
5． 读板前，用不含棉纤维的清洁纸将板底部抹净。
6． 生长质控孔（G孔）无菌生长时不要读板、控制孔（C孔）出现细菌生长或G孔无菌生长时不要读取药敏结果。