第1个回答 2013-07-29
1�纯化蛋白质：用于序列分析的蛋白质应是分子大小均一，电游呈现一条带具有一定纯度的样品。 2�分析蛋白质的氨基酸组成：用酸、碱等将蛋白质肽链水解为游离氨基酸，再用电泳、层析等方法分离、鉴定所有游离氨基酸的种类和含量，现在可用氨基酸自动分析仪来快速测定。 3.测定肽链中N末端和C末端为何种氨基酸；若蛋白质由两条以上肽链组成，通过末端氨基酸的测定还可估计蛋白质中的肽链数目。 ① N末端氨基酸测定：二硝基氟苯、丹磺酰氯都可与末端氨基反应，再用盐酸等将肽链水解，将带有二硝基氟苯或丹磺酰氯的氨基酸水解下来，即可分离鉴定出为何种氨基酸，因丹磺酰氯具强烈荧光更易鉴别。 ② C末端氨基酸测定：用相应的羧肽酶将C末端氨基酸水解下来，因各种羧肽酸水解氨基酶的专一性不同，故可对C末端氨基酸做出鉴定。 4.将链间、链内二硫键打开，否则会阻碍蛋白水解溶剂的作用，常用巯基化合物还原法。 5.选择适当的酶或化学试剂将肽链部分水解成适合作序列分析的小肽段，常用的方法有： ①胰蛋白酶法：水解赖氨酸或精氨酸的羧基形成的肽键，故若蛋白质分子中有4个精氨酸或赖氨酸残基，可得5个肽段。 ②胰凝乳蛋白酶法：水解芳香族氨基酸羧基侧的肽键 ③溴化氰法：水解甲硫氨酸羧基侧的肽键。 6.测定各肽段的氨基酸排列顺序： 一般采用 Edman降解法。 因 PITC(异硫氰酸苯酯)只与N末端氨基酸作用，用冷稀酸将此末端残基水解下来，鉴定为何种氨基酸衍生物，残留的肽段N末端可继续与PITC反应，依次逐个鉴定出氨基酸的排列顺序。 7.多肽链用两种方法分别裂解成几组肽段，并测定每一方法中每一肽段的氨基酸排列顺序，肽段重叠法确定整条肽链的氨基酸顺序，若用两种方法找不出重叠肽段，就需用第三种、第四种方法，直到找出重叠肽段。 8.确定二硫键位置： 用电泳法将拆开二硫键的肽段条带与未拆开二硫键的条带进行对比即可定位二硫键的位置。 如此以来，一个完整蛋白质分子的一级结构即可被测定