在 R 中
标准化的主要目的是去除测序数据的技术偏差： 测序深度 和 基因长度 。
测序深度 ：同一条件下，测序深度越深，基因表达的 read 读数越多。
基因长度 ：同一条件下，不同的基因长度产生不对等的 read 读数，基因越长，该基因的read读数越高。
对给定的基因组参考区域，计算比对上的 read 数，又称为 raw count （RC）。
计数结果的差异的影响因素：落在参考区域上下限的read是否需要被统计，按照什么样的标准进行统计。
RPM方法：10^6 标准化了测序深度的影响 ，但没有考虑转录本的长度的影响。
RPM适合于产生的read读数不受基因长度影响的测序方法，比如miRNA-seq测序，miRNA的长度一般在20-24个碱基之间。
RPKM/FPKM方法： 10^3 标准化了基因长度的影响，10^6标准化了测序深度的影响。
FPKM方法与RPKM类似，主要针对双末端RNA-seq实验的转录本定量。在双末端RNA-seq实验中，有左右两个对应的read来自相同的DNA片段。在进行双末端read进行比对时，来自同一DNA片段的高质量的一对或单个read可以定位到参考序列上。为避免混淆或多次计数，统计一对或单个read比对上的参考序列片段（Fragment），来计算FPKM，计算方法同RPKM。
RPKM/FPKM适用于基因长度波动较大的测序方法，如lncRNA-seq测序，lncRNA的长度在200-100000碱基不等。
TPM的计算方法也同RPKM/FPKM类似，首先使用式2计算每个基因的表达值，去除基因长度的影响。随后计算每个基因的表达量的百分比，最后再乘以10^6，TPM可以看作是RPKM/FPKM值的百分比。
TPM值就是RPKM的百分比
相当于重新标准化的文库，保证每个样本中所有TPM的总和是相同的。
raw count 作为原始的read计数矩阵是一个绝对值，而绝对值的特点是规模不同（基因长度、测序深度），不可以比较。进行这些基因标准化方法的目的是将count矩阵转变为相对值，去除技术偏差的影响，使后续的差异分析具有统计学的意义。
limma/voom，edgeR，DESeq2，转录组差异分析的三大R包!