纯干货Western blot （WB）条带灰度统计与GraphPad作图

Question

如题所述

Answer 1

一、 Western blot灰度值计算实操详解</

1.1 Image J灰度分析</

首先，打开Image J软件，启动界面如图1所示。
选择“File”>“Open”，找到你需要分析的Western blot图片，如内参β-ACTIN，如图2所示。
将图片转换为8位灰度图，操作路径为“Image”>“Type”，如图3所示。
接下来，对背景进行统一处理。点击“Process”>“Subtract Background”，选择rolling ball radius为50，选中“Light background”选项，如图4和图5，这样可以有效消除背景干扰。
然后，进行黑白翻转操作，通过“Edit”>“Invert”，如图6所示，便于后续分析。
设置测量参数，进入“Analyze”>“Set Measurements”，选择Area、Mean gray value、min& max gray value和Integrated density，如图9和图10所示，单位设为像素pixels，如图11和图12所示。

二、数据采集与条带测量</

在条带选择上，如图13，红色箭头标记的矩形、椭圆或不规则选框，我倾向于使用矩形框选，便于测量。测量印记灰度值时，选取对应条带，通过快捷键Ctrl+M或菜单“Analyze”>“Measure”，确保使用同一框进行测量，如图14。

2.2-2.4步骤中，测量得到的数据和条带信息如图15所示，IntDen即为光密度数值，之后记得保存数据，如图16和图17。

三、GraphPad统计分析与图表制作</

在Excel中预处理数据，以target protein和β-Actin的灰度值为基础，计算相对表达，如图18所示。接着，使用GraphPad，选择“Column”，创建数据表格，如图19。

在新建的表格中，如图20所示，为表格命名并整理数据，确保时间和内容清晰，数据按要求粘贴并进行统计分析，如图21和图22。

3.6步骤，非配对t test设置如图23所示，理解P值和星标的重要性，用于图表解释，如图24。

完成数据分析后，选择合适的图表类型，如图25，根据差异调整误差线。图26展示默认图表样式。

3.9.1-3.9.3部分，对图表进行美化，如删除多余标题、调整Y轴起始值和颜色，如图27、图28和图30。

四、导出与结束语</

最后，通过菜单“Export”导出你的图表，如图32所示，确保设置好输出格式、像素大小和命名等参数，如图33。记住，每一步都要细心操作，感谢你的阅读与实践，愿你的科研之路顺利，如图33所示的格言提醒我们，感恩遇到，释怀错过。