酶切实验
本实验学习用限制性核酸内切酶(Restriction
endonuclease)EcoRI
切割λDNA及质粒pBR322DNA，琼脂糖凝胶电泳后观察酶切结果。
【原理】
λDNA
是大肠杆菌的一种温和噬菌体DNA，双股线状，分子大小为48.5
kb。
EcoRI酶可识别DNA中
G↓AATTC核苷酸序列，并在箭头处将其切开。λDNA含有5个EcoRI酶识别位点，可将λDNA切成6个大小不同的片断。pBR322
DNA为人工构建的质粒DNA,
分子大小为4.3
kb，含有1个EcoR
I酶切点，切割后由环状DNA变为线形DNA。
【材料】
1.λDNA(0.1ug/ul)，pBR322
DNA(0.25
ug/ul)
2.限制性内切酶EcoRI
3.EcoRI
酶切缓冲液(Buffer
solution
10×)
4.去离子水
5.电泳及染色用材料
【方法】
1.取洁净EP管2只，按表10-1加入各成分。
2.混匀，放370C水浴1-2h。65℃水浴10min，再放4℃冰箱8min终止反应。部分酶切DNA片段用于DNA连接实验，另一部分放4℃冰箱，待琼脂糖凝胶电泳检测。
(二)DNA连接实验
T4
DNA
连接酶是一单链多肽，分子量为68,000道尔顿，它能催化双链DNA上相邻的3ˊ羟基和5ˊ磷酸末断形成磷酸二脂键。λDNA用EcoRI酶切割后形成的6个片断均具有粘性末端(Cohesive
ends)，在T4
DNA
连接酶作用下，可连接成原来的线状DNA
【材料】
1.λDNAEcoRI酶切片段
2.T4
DNA连接酶
3.T4
DNA连接酶缓冲液(10×)
4.去离子水
【方法】
1.取洁净EP管1只，分别加入：
①去离子水
7ul,
②T4
DNA连接酶缓冲液(10×)
2
ul，
③λDNA酶切片段(已65℃10分钟灭活)10ul
④T4
DNA连接酶1ul
2.混匀后，放13℃水浴过夜，待电泳检测。
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可以参考
www.bio1000.com/zt/dna/164670.html可以到上面看下实验具体细节