第1个回答 2015-11-26
理化检测法： 理化检测法是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定其含量的方法，如高效液相色谱
法、气相色谱法、比色法、荧光分光光度法等，最常用的是高效液相色谱及其联用技术。这类方法大多既能进行定性分析，也能进行定量检测，而且检测速度快，灵敏度、特异性和分辨率均很高，重复性好，应用广泛。但是其检测要求高，需要昂贵的检测设备，检测程序较复杂，检测费用较高，一般应用于科研，很难在基层推广应用。
1.1 高效液相色谱法
高效液相色谱法（HPLC）是一种快速的分离分析技术，其中反相HPLC发展最快。它引入了气相色谱理论，在技术上采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分离速度快、效果好和操作自动化，几乎所有的化合物包括高极性/离子型待测物和大分子物质均可用HPLC进行测定。其原理是利用液体作为流动相，通过高压，使被测样品和流动相经过色谱柱，样品中的成分在色谱柱中反复分配，使各组分分离，然后由检测器检测各组分含量。由于HPLC不需高温条件，故适于易受热分解、不易气化的残留成分分析。HPLC的特点是灵敏度高、检测限低、方法稳定，因此广泛应用于青霉素类、四环素类等抗生素及呋喃类（呋喃西林、呋喃唑酮）药物、磺胺类药物的残留检测。但在利用高效液相色谱法检测牛奶中青霉素残留时，要经过样品处理（包括样品的提取、脱蛋白、离心、层析柱净化、衍生化等步骤）、残留药物分离和残留药物检测3步程序[3]Marchetti[4]等使用此方法检测牛奶中的青霉素G、青霉素V、苯唑西林、邻氯青霉素、双氯青霉素，其中青霉素G的检测限度为4μg/L，其它4种青霉素的检测限为10μg/L。Furusawa[5]使用HPLC法检测牛奶中青霉素G的残留量，检测灵敏度为0.004μg/mL。
1.2 色谱质谱联用技术
色谱质谱联用法可扬长避短，一般兼分离、定量和定性（分子结构信息）于一体，因而特别适用于确证性分析。联用技术实现了高效层析分离和检测联机，可用微电脑控制层析条件、程序并且可以进行数据处理，其特异性、灵敏度和重复性均较好，并可一次同时完成同一样本中多种药物及其代谢物检测。对于分析牛奶中青霉素类抗生素，质谱作为一种专一检测器已获得广泛应用。常见的联用技术有薄层色谱-质谱（TLC-MS）、气相色谱一质谱（GC-MS）、液相色谱-质谱（LC-MS）、超临界流体色谱-质谱（SFC-MS）等[6] 。
近年来，还有研究者尝试用高效薄层色谱（HPTLC）、超临界流体色谱（SFC）和毛细管区域电泳法（CZE）等进行抗生素残留的检测[7]。这些方法能对抗生素进行定性、定量测定，灵敏度较高，但一般需要昂贵的仪器设备、大量复杂的前处理、熟练的技术人员及较长的分析周期，而且只能用于单个样本的检测，因而不常用。
2 微生物学检测方法
目前，牛奶中抗菌药物残留的微生物学分析方法一般分为微生物生长抑制法、微生物受体法和酶促比色法。
2.1 微生物生长抑制法
其测定原理基于抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作用，可定性或定量确定样品中抗生素的残留。其工作菌株大多选用枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、藤黄八叠球菌等敏感菌株[8]。目前，常用的微生物生长抑制法主要有以下几种。
2.1.1 纸片法
即PD法（Paper Disc）[9]，当样品中存在抑菌物质时，在纸片周围形成一个清晰的抑菌圈。在检测过程中，培养基内加入溴甲酚紫指示剂，当样品中含有抑菌物质时，纸片周围有一个清晰的浅蓝色的抑菌圈。抑菌圈的大小决定于抑菌物质的种类和浓度。检测限可达0.008IU/mL以下，一般在4h内可获得结果。
2.1.2 戴尔沃-p法和戴尔沃-p多次测试法[10]
戴尔沃-p法是将牛奶样品和含有营养剂及pH值指示剂的片剂加入到安瓿瓶中。安瓿瓶中已含有接种了嗜热脂肪芽孢杆菌的琼脂，当没有抑菌物质时，细菌生长产生足量的酸，使内含的pH值指示剂发生颜色变化，从紫色变为蓝色；当存在抑菌物质时，细菌的正常生长被抑制，产酸被延滞，内含的pH值指示剂不发生颜色变化。戴尔沃－p多次测试法是Delvotest－p法的改良方法，它们的原理一样，但戴尔沃－p多次测试法不使用安瓿瓶，而是使用具有96个测试孔的聚苯乙烯板，优点是一次能做96个试验。随着检测方法的发展，这2种方法已被美国官方分析师协会（AOAC）所接受，用于乳和乳制品中β-内酰胺类抗生素的检测。
2.1.3 亮黑还原法[11]
简称BR-test。测试时，在样品中加入含有嗜热脂肪链球菌的琼脂片，然后培养。在培养期间，菌种繁殖使内含的氧化还原指示剂还原成黄色。当样品中含有抑菌物质时，菌种生长受抑制，培养基琼脂保持亮黑指示剂原来的蓝色。BR-test法已改良过多次，其中有名的BR-test“Blue Star”法，已被加拿大官方接受使用[12]。
除了这些检测方法外，藤黄微球菌法（ Sarcina lutea test）、三磷酸腺苷法（ATP test）、三碟法（ three-plate test）、六碟法（ six-plate test） 等都是微生物抑制法。这些方法无一例外地都需要对微生物进行培养，同时存在检测时间长，检测极限难以满足要求，人为因素影响大及很难实现标准化定量检测等缺点。但由于成本较低，在我国基层乳品企业还有应用。
2.2 微生物受体法
微生物受体分析法CHARM I和CHARM II比生长抑制分析法用途更广，可适用于检测不同基质样品中各种抗生素残留。CHARM I是专用于牛奶中β-内酰胺抗生素残留的检测方法，也是美国AOAC承认的第一个快速测定法。这个方法非常快速和灵敏，一个牛奶样品分析只需15min。CHARM II法的原理是，一类抗生素的功能团和加入的微生物细胞壁上或细壁内的受体位点进行不可逆的结合反应。该法往往利用同位素标记的抗生素与样品中的抗生素残留竞争结合位点，当样品中含有抗生素残留时，残留的抗生素分子阻止放射性标记的抗生素与受体位点结合。因此，在位点上结合的标记物越多，说明样品中抗生素越少。在基质中添加一定浓度的抗生素来建立一个控制点，用于判断样品是否存在抗生素残留。
2.3 酶比色法[13]
酶比色法来自于Penzyme法，是用于快速检测牛奶中β-内酰胺类抗生素的定量酶比色法。其原理是测定β-内酰胺类抗生素对DD-羧肽酶灭活的程度。在此酶的存在下，链酶菌会释放D-丙氨酸，D-丙氨酸被氧化成丙酮酸的同时会产生过氧化氢，而过氧化氢可使用氧化还原显色指示剂来测定。检测时间为15min，指示剂黄色不变，则结果为阳性；如指示剂变为粉红色，则结果为阴性；颜色处于粉红和黄色中间，则牛奶中的β-内酰胺类抗生素的量可以定量估计在0～0.017IU/mL之间。
3 免疫分析法
目前，应用的抗生素残留免疫分析技术主要分为两大类：一是以抗原抗体识别为核心反应的酶联免疫吸附法；二是以受体配体识别为核心反应的受体吸附分析法。
3.1 酶联免疫吸附法
ELISA是当前应用最广、发展最快的免疫测定技术，具有灵敏度高，特异性强，处理量大等特点。当前关于ELISA法检测抗生素残留的研究报道以竞争ELISA法为主[14]。Strasser[15]等采用直接竞争ELISA法检测牛奶中青霉素类抗生素残留，检测范围为2～32ng/mL；Samsonova[16]等用间接竞争ELISA法检测牛奶中氨苄青霉素残留，最小检测限为5.0ng/mL。Cliquet[17]等利用间接竞争ELISA法可同时检测到氨苄青霉素、青霉素G、羟氨青霉素、苯唑青霉素、双氯青霉素，检测灵敏度都在欧盟最大残留量（MRL）限度内。
3.2 受体吸附分析法
受体吸附分析法是继免疫吸附法之后检测抗生素残留的受体配体之间的特异性识别反应。国外在此领域研究较早，我国的研究由于起步较晚，目前未见相关报道[18]。Setford[19]等应用固定了青霉素结合蛋白的工作电极检测牛乳中青霉素G残留，当样品中青霉素G浓度分别为5μg/kg和10μg/kg时，测得的抑制率分别为33.5％和77.1％。此方法的变异系数为4.2％～26.4％。近年来免疫检测又出现了许多新技术，如免疫传感器、流动注射免疫分析技术、荧光偏振光免疫分析等。Eva Gustavsson[20]等使用表面等离子共振传感器（SPR），设计了具有羧肽酶活性的受体蛋白活性抑制试验以检测牛乳中β-内酰胺残留。通过相应抗体来检测底物量进而计算羧肽酶活力的变化，实现了定量检测牛乳中的青霉素G残留。此方法对于青霉素G的检测极限为2.6μg/kg；连续3天测定已知青霉素G残留量为4μg/kg的样品，此方法的变异系数为7.3％～16.0％，回收率为108％～118％。Cacciatore[21]等使用等离子共振传感器检测了牛乳中β-内酰胺抗生素残留。其反应通过地高辛标记的氨苄青霉素与样品中β-内酰胺抗生素竞争固定于等离子共振传感器传感片表面的青霉素受体的结合位点，实现了牛乳中β-内酰胺抗生素的定量检测。此方法对青霉素G的检测极限是4μg/kg 。